張 婷，吳永強，王 鼎，陳 波，賴 清，司原成，莫曦雅

(貴州中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，貴州 貴陽 550025)

毫針針刺是醫(yī)者借助毫針在人體特定部位施以一定的手法操作，以防治疾病的一種中醫(yī)臨床外治法，具有疏通經(jīng)絡、調(diào)和陰陽、扶正祛邪的作用?，F(xiàn)代研究認為針刺療效受患者生理基礎(chǔ)、情志狀態(tài)、腧穴性質(zhì)、針刺手法、針具選擇等多方面的影響[1]，其中機能狀態(tài)是針刺療效發(fā)揮的基礎(chǔ)[2]。但目前對針刺機理的研究多集中于臨床治療，針刺對穴區(qū)局部激活作用的現(xiàn)代醫(yī)學研究仍較為缺乏。因此，本研究選取電學特性、生物熱學特性和能量代謝3方面，探討佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)狀態(tài)下毫針針刺對穴區(qū)局部的影響，為毫針針刺的現(xiàn)代生物醫(yī)學機制提供進一步的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(200±20)g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0014。動物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學動物實驗室，室溫(22±1)℃，相對濕度(50±5)%，光照12 h明暗交替(明期8：00-20：00)，大鼠自由攝食進水。實驗過程中對大鼠的各種處理遵循國家科學技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 弗氏完全佐劑(SLBZ9884，美國Sigma-Aldrich)；水合氯醛(1113A20，北京雷根生物技術(shù)公司)；大鼠三磷酸腺苷(ATP)/二磷酸腺苷(ADP)ELISA試劑盒(ZK-R4622/ZK-R3711，深圳子科生物科技公司)。

電子天平(WT型，杭州萬特衡器公司)；紅外體溫計(CK-T1503，深圳長坤科技公司)；直流低電阻測試儀(YP2512，深圳永鵬儀器公司)；凍存管(607001，美國NEST)；液氮罐(YDS-20，青島海爾特種電器公司)；酶標分析儀(Infinite F50，瑞士Tecan)；一次性無菌針灸針(0.30mm×25mm，190102/53，吳江云龍醫(yī)療器械公司)。

1.3 動物分組與造模方法 將32只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常組與AA組2個大組，每大組16只；各組再按窩別、體重、活躍度因素配對后隨機分為非針刺組與針刺組2個小組，每小組8只。AA模型采用CFA造模方法復制[3]：每只大鼠右足跖皮內(nèi)注射0.1 mL CFA以致炎。繼續(xù)飼養(yǎng)11 d后完成造模。

1.4 干預方法 各組大鼠稱重后，于右側(cè)“足三里”穴周備皮，穴位定位參考《實驗針灸學》附錄四，定位為：膝關(guān)節(jié)下外側(cè)，腓骨小頭下5 mm。各組大鼠稱重備皮后分別用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，麻醉劑量(mL)=大鼠重量(g)×0.3 mL/100g。

針刺組麻醉后消毒右側(cè)“足三里”穴，毫針直刺5 mm，按(60±2)r/min的頻率均勻捻針，捻轉(zhuǎn)幅度為180°～360°，捻針5 min，留針10 min，然后再捻針5 min，以此類推，共捻針3次，于第3次捻針完畢后出針，每天1次，共操作3 d。非針刺組麻醉后與針刺組做相同的抓取、固定，不施加其他處理。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 穴區(qū)溫度檢測 各組大鼠行末次刺激后俯臥位固定，用紅外體溫計溫度探頭置于穴區(qū)皮膚上3～5 cm處，每隔10 s記錄1次溫度值，記錄1 min，共記錄6次，取平均值為穴區(qū)溫度值。

1.5.2 穴區(qū)電阻檢測 溫度測量后，各組大鼠繼續(xù)俯臥位固定，以進針點為中心，在直徑5mm范圍內(nèi)用75%酒精進行涂擦，無關(guān)電極蘸生理鹽水后，固定在右側(cè)后肢足掌中，并將蘸少許生理鹽水溶液的探測電極分別置于被測穴位進針點和其上下左右各1.5 mm 處共5個點觀測電阻，取平均值為穴區(qū)電阻值。

1.5.3 ELISA法檢測穴區(qū)ATP、ADP含量 于第3 d檢測完溫度、電阻后，將大鼠脫頸處死并立即取材。取材方法為：于大鼠右側(cè)后肢進一步備皮、消毒，切開皮膚后，以大鼠針刺點為圓心，直徑約5 mm、垂直深度約5 mm的區(qū)域內(nèi)取穴區(qū)皮下組織塊約200 mg。組織塊取下后用生理鹽水沖洗，置入凍存管后于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

ELISA法檢測組織塊ATP、ADP含量：組織勻漿后取上清液作為檢測標本，按照試劑盒說明書稀釋為6個濃度梯度，稀釋后各孔加樣量都為50 μL，設(shè)空白孔及樣品孔。每孔加入酶標試劑100 μL，空白孔除外，并用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液洗滌，每孔加滿洗滌液，靜置60 s后棄去，如此重復洗板5 次。顯色，加入底物A和B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，450 nm波長依序測量各孔的吸光度值，計算樣品含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 正常組大鼠正常飲食飲水，毛色光澤、大便正常。AA組大鼠與正常組相比，精神萎靡，活動減少，毛發(fā)凌亂晦暗，糞便稀溏，有舔舐右后足行為。其造模后18 h，右足腫脹達高峰，持續(xù)約3 d后逐漸減輕，造模后8 d再度腫脹，11 d時右側(cè)足爪紅腫，右足趾部觸痛明顯，伴其余三足不同程度紅腫，耳廓血管充血，耳部、尾部可見炎性結(jié)節(jié)，提示造模成功。正常大鼠和AA大鼠針刺后，穴區(qū)進針處均可見一暗紅色微小圓孔，余穴區(qū)局部無紅腫等改變。干預后，正常針刺組較正常非針刺組，大鼠一般情況無明顯變化。AA針刺組較AA非針刺組，大鼠活動稍增加。

2.2 各組大鼠穴區(qū)電阻值比較 正常組、AA組針刺后，穴區(qū)電阻值均較各自的非針刺組降低(P<0.01)；但AA組穴區(qū)電阻降低幅度較正常組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 毫針針刺“足三里”對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠穴區(qū)電阻的影響

2.3 各組大鼠穴區(qū)溫度值比較 正常組、AA組針刺后，穴區(qū)溫度值均較各自的非針刺組降低(P<0.01)；且AA組穴區(qū)溫度降低幅度較正常組大(P<0.01)。見表2。

表2 毫針針刺“足三里”對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠穴區(qū)溫度的影響

2.4 各組大鼠穴區(qū)ATP/ADP比值比較 正常針刺組較正常非針刺組，穴區(qū)ATP/ADP比值升高(P<0.01)；AA針刺組較正常針刺組，穴區(qū)ATP/ADP比值更低(P<0.05)；AA組較正常組，穴區(qū)ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度偏小(P<0.01)。見表3。

表3 毫針針刺“足三里”對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠穴區(qū)ATP/ADP的影響

3 討論

佐劑性關(guān)節(jié)炎以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征表現(xiàn)，屬中醫(yī)學“痹證”范疇，其主要病機是氣虛血瘀、脈絡瘀阻[4]。針刺具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]，能有效控制AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥?！鹅`樞》有云“著痹不去，久寒不已，卒取其三里為干”，《神灸經(jīng)綸》言“上中下三部痹痛，足三里”。“足三里”穴作為足陽明胃經(jīng)的合穴、下合穴，對痹證有著良好的治療效果，同時是針刺治療AA疾病時選擇頻次最高的穴位[7]。

自“良導絡”理論提出后，大量學者對人體腧穴的電學特性開展了研究工作，人體穴位存在電阻抗特性和伏安特性，呈現(xiàn)低電阻、高電位特征[8]，這與穴區(qū)組織一氧化氮與神經(jīng)一氧化氮合酶蛋白表達增高和去甲腎上腺素合成與釋放的改變相關(guān)[9]。針刺可以改變穴區(qū)局部表皮角質(zhì)層與結(jié)締組織形態(tài)，改變細胞內(nèi)液與細胞外液的電解質(zhì)梯度，從而引起穴位局部的導電性提升、電阻下降[10]。孫艷紅等[11]選取60例健康受試者的“足三里”和“上巨虛”穴分別行留針、補法、瀉法三種針刺手法，觀察到針刺操作后經(jīng)穴皮膚下電阻抗均降低。周丹等[12]運用原絡配穴法和合募配穴法觀察手陽明大腸經(jīng)腧穴針刺后的皮膚電阻，發(fā)現(xiàn)針刺后腧穴皮膚電阻值均較針刺前下降。本研究中，針刺正常組、AA組大鼠均可以降低腧穴的電阻值，AA組穴區(qū)電阻降低幅度較正常組無顯著差異，說明AA狀態(tài)對毫針針刺的降電阻效應無影響作用。

腧穴的熱敏特性以溫度為外在表現(xiàn)形式，針刺對穴區(qū)的溫度具有雙向調(diào)節(jié)作用。李璐等[13]通過比較健康者和腦出血患者“足三里”穴留針期間的穴區(qū)體表溫度，發(fā)現(xiàn)后者穴區(qū)升溫較前者幅度更低。紀青灼[14]利用醫(yī)用紅外熱像儀觀察針刺“沖陽”穴對健康者皮膚溫度的影響，發(fā)現(xiàn)針刺即刻和針刺5 min時穴區(qū)溫度均較針刺前降低，而針刺5 min至出針前，穴位溫度持續(xù)上升，針刺15 min后穴區(qū)溫度較針刺前升高。蔣珞琦[15]對健康受試者“曲池”穴行不同針刺手法，證實了“燒山火”手法可使穴區(qū)皮溫升高，而“透天涼”手法使穴區(qū)皮溫降低。本研究中所采取的針刺方法對于大鼠“足三里”穴具有明顯降溫作用，AA組針刺后穴區(qū)溫度較非針刺狀態(tài)降低，且較正常組溫度調(diào)節(jié)幅度更大，說明AA狀態(tài)對毫針針刺的降溫效應有增效作用。

能量釋放、轉(zhuǎn)移、存儲和利用的過程被稱作能量代謝，是細胞維持基礎(chǔ)生理活動的基本特征。機體體內(nèi)各種能源物質(zhì)氧化所釋放的能量，一部分以高能磷酸鍵為載體貯存于ATP中[16]。1分子ATP和1分子AMP可以催化反應生成2分子ADP[17]，ATP通過與ADP的相互轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)了能量的儲存和釋放[18]。ATP/ADP比值反應能量的代謝水平：ATP生成增多時，ATP/ADP比值升高；ATP水解增多時，ATP/ADP比值下降。針刺能促進穴區(qū)局部A3受體拮抗劑、p38MAPK激酶、P-P50和P-P65的表達[19-20]，引起穴區(qū)局部能量代謝水平的提高。本研究中，針刺提高了正常組大鼠穴區(qū)ATP/ADP，AA組大鼠針刺降低了穴區(qū)ATP/ADP，AA狀態(tài)可明顯逆轉(zhuǎn)針刺對腧穴ATP/ADP的增調(diào)效應。

綜上，毫針針刺能降低穴區(qū)局部的電阻與溫度，提高穴區(qū)局部能量代謝水平。AA狀態(tài)下毫針針刺激活腧穴的作用與正常機體狀態(tài)存在不同。AA狀態(tài)對毫針針刺的降電阻效應無影響作用，對毫針針刺的降溫效應有增幅作用，對毫針針刺的ATP/ADP增調(diào)效應有逆轉(zhuǎn)作用。針刺對AA的治療作用除了通過增強腧穴電敏特性達到外，還可能主要通過降低穴區(qū)溫度和降低能量代謝實現(xiàn)。其它不同機能狀態(tài)下毫針針刺的局部效應是否存在相同規(guī)律，有待于今后進一步的實驗研究。