張 科

(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津 300052)

阿爾茲海默癥(alzheimer’s disease，AD)是一種發(fā)病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，65歲以上的人群多發(fā)，確診后很難控制，且目前治療效果不佳[1-3]。隨著全球人口老齡化社會的到來，AD 的發(fā)病率及患病人數(shù)逐年增加，嚴重威脅老年人群的健康，給人們的生活和社會帶來沉重的負擔，已經(jīng)成為亟待解決的一個世界難題[4-7]。現(xiàn)代研究表明，AD的可能的主要病理特征有：β-淀粉樣蛋白斑塊(β-amyloid plaques，Aβ斑塊)、過度磷酸化Tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結(jié)、乙酰膽堿遞質(zhì)減少、炎癥反應、神經(jīng)元丟失及淀粉樣血管病等[8]。但是AD發(fā)病機制復雜，與多種因素有關，目前確切原因尚不明確。研究表明，氧化應激損傷參與AD的發(fā)病過程，并在AD發(fā)病機制的眾多學說中，氧化應激學說與其他諸多假說之間存在間接或直接的聯(lián)系[9]。目前AD的治療藥物主要有M型膽堿能受體激動劑、膽堿酯酶抑制劑、抗氧化藥物、抑制β-淀粉樣蛋白沉積藥等[10-11]。由于這些藥物的治療效果仍不太理想，同時某些化學合成類藥物還會造成一定的不良反應[12]。因而進一步從中藥中探索新的AD治療藥物，是一個重要的研究趨勢[13]。

天麻素(gastrodin，GAS)，是從蘭科植物天麻的干燥根塊中提取的一種天然酚類物質(zhì)，具有較好的鎮(zhèn)靜、安眠、抗炎、抗氧化自由基作用，對神經(jīng)衰弱、失眠、頭痛有緩解作用[14]。研究表明，GAS通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活化，減少Aβ蛋白的沉積保護神經(jīng)元，起到改善學習和記憶功能障礙的作用[15-17]。在AD防治方面具有重要的理論意義，但對于GAS的潛在靶點及作用機制仍然不明確。

近年來，基于網(wǎng)絡藥理學對中藥復方或者單體成分進行物質(zhì)基礎、靶點、通路分析的研究成為熱點。該方法通過構(gòu)建多層次網(wǎng)絡，從基因、分子和細胞層面闡釋藥物的作用機制。PharmMapper是一款通過整合DrugBank、BindingDB、Target Bank和PPTD數(shù)據(jù)庫對藥效團模型進行反向預測靶點的工具，它能快速預測藥物分子作用靶標[18]。本文擬采用該方法探究GAS防治AD的潛在靶點及作用機制，為其進一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 預測天麻素的作用靶點 在Pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索關鍵詞“Gastrodin”獲取天麻素(CAS號：62499-27-8)的化學結(jié)構(gòu)式，保存為“SDF”格式文件。利用Chem3D 18.0進行MM2力場優(yōu)化后保存為mol2格式文件并上傳至PhrmMapper平臺服務器，設定物種為人類，選取z’-scoer>0[19]進行靶點預測，得到結(jié)果作為天麻素的靶點。并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫，將靶點蛋白名稱(Protein name)轉(zhuǎn)換標準基因名(Gene symbol)，得到天麻素的潛在靶點。

1.2 篩選天麻素抗AD的靶點 打開Genecards數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer’s Disease”為關鍵詞檢索，收集AD疾病靶點，以 Excel 格式導出，然后將1.1中潛在靶點的標準基因名與疾病靶點基因取交集，作為天麻素抗AD的候選靶點。

1.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡及關鍵靶點的篩選 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction networks，PPI)是由蛋白通過彼此之間的相互作用構(gòu)成，來參與生物信號傳遞、基因表達調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細胞周期調(diào)控等生命過程的各個環(huán)節(jié)。系統(tǒng)分析蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關系，對了解生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的工作原理，了解疾病等特殊生理狀態(tài)下生物信號和能量物質(zhì)代謝的反應機制，以及了解蛋白之間的功能聯(lián)系都有重要意義[20]。應用STRING數(shù)據(jù)庫對1.2項的候選靶點基因進行分析，使用Cytoscape軟件將分析結(jié)果繪制成天麻素抗AD的PPI 網(wǎng)絡，并對網(wǎng)絡進行拓撲結(jié)構(gòu)分析。使用Cytoscape軟件中的“Generate style from statistics”工具設置網(wǎng)絡節(jié)點的大小和顏色。節(jié)點的大小和顏色深淺代表Degree值的大小，邊的粗細反映了Combine Score的大小，從中篩選出Degree值排名靠前的靶點作為重要靶點。

1.4 功能注釋和KEGG通路富集分析 DAVID不僅是個生物數(shù)據(jù)庫，也是一款在線分析軟件?？梢杂脕碜龌虻牟町惙治?，系統(tǒng)的生物功能注釋信息，進行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和KEGG通路分析[21]。將候選靶點導入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人，進行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導出數(shù)據(jù)，對生物過程(P<0.05)和信號通路(P<0.05)進行篩選，并進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 天麻素靶點的預測結(jié)果 經(jīng)PhrmMapper平臺服務器對天麻素進行靶點預測，將所得靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換為標準基因名，刪除重復和無效靶點，共獲得有效靶點69個，詳見表1。

表1 天麻素靶點預測結(jié)果

2.2 成分靶點與疾病靶點的交集 Genecards數(shù)據(jù)庫檢索得到10972個AD相關靶點基因，使用在線韋恩圖工具獲得55個天麻素預測靶點與AD的共有基因，見圖1、圖2。具體為：NUDT9、CA12、GSTP1、CHEK1、PGR、MTAP、BCHE、TGFBR2、FCAR、CA1、CCNA2、RTN4R、CA2、BMP7、HSPA8、PYGL、QPCT、ANg，HK1、GALK1、DAPK1、F2、PPARg，AMD1、PAH、DHFR、MMP3、CTSK、PLK1、MMP8、ESR1、CSNK1G2、BAG1、RHEB、MIF、CRAT、AZGP1、ESR2、ADE4D、

圖1 交集基因的韋恩圖

ADPK1、ESRRg，GPI、SORD、LDHB、B3 gAT1、EPHB4、GSK3B、PLAU、HEXB、DPP4、CES1、CASP3、ATOX1、LCK、HMGCR。

2.3 PPI 網(wǎng)絡的分析 將共有基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進行分析，結(jié)果以TSV格式導入Cytoscape(v 3.7.1)軟件進行分析和可視化處理，節(jié)點的大小和顏色的深淺表示節(jié)點的度(Degree)的變化。分析結(jié)果顯示：PPI網(wǎng)絡包含44個節(jié)點，92條邊，平均節(jié)點Degree值為3.35，見圖2；使用軟件中Network Analyzer選項中的Network Analysis模塊進行分析，結(jié)果網(wǎng)絡中Degree值排名前20的靶點包括ESR1、CASP3、HSPA8、CCNA2、LDHB、PLAU、DHFR、PGR、GSK3B、BMP7、PPARg，MMP3、CHEK1、GSTP1、GPI、BAG1、F2、SORD、CTSK、MMP8。其中ESR1(Degree=17)，CASP3(Degree=15)，HSPA8(Degree=7)，CCNA2(Degree=7)，LDHB(Degree=7)，PLAU(Degree=6)在網(wǎng)絡中具有較高的Degree值，網(wǎng)絡參數(shù)見表2。

圖2 潛在靶點與AD靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖

表2 蛋白互作網(wǎng)絡參數(shù)

2.4 功能注釋分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4.1 GO富集分析結(jié)果 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫得到天麻素與AD的交集基因GO功能富集分析的結(jié)果：GO條目79個(P<0.05)，包括46個生物過程(BP)，8個細胞組成(CC)，25個分子功能(MF)，主要涉及生物學功能與過程包括：肽基蘇氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、激酶活性、碳酸鹽脫水酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等，具體結(jié)果見圖3和表3。

表3 潛在靶點與AD靶點交集基因 GO 富集分析結(jié)果(P<0.05，BP、MF、CC的 PValue值前5注釋)

圖3 GO富集分析結(jié)果

2.4.2 KEGG通路富集分析結(jié)果 通路富集分析結(jié)果得到信號通路8條(P<0.05)，包括氨基糖和核苷酸糖代謝、氮代謝、AMPK信號通路、胰島素信號通路、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甲狀腺激素信號通路、細胞周期，富集結(jié)果見圖4和表4。

表4 潛在靶點與AD靶點交集基因 KEGG 通路富集分析結(jié)果(P<0.05)

圖4 KEGG富集分析的8條通路圖

3 討論

從蛋白互作網(wǎng)絡圖分析可知，雌激素受體(ESR1)，半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)，尿激酶型纖溶酶原激活因子(PLAU)在網(wǎng)絡中處于關鍵地位。研究發(fā)現(xiàn)，衰老過程中雌激素受體的活性、表達水平及分布變化會引起大腦中雌激素的變化，而AD病情發(fā)展的一個重要的危險因素就是腦源性雌激素的下降[23]。Aβ毒性假說是目前AD 致病機制中占主導地位的學說。淀粉樣前體蛋白APP由于基因突變，在β分泌酶作用下產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的Aβ，當其含量升高后，細胞并不能將其代謝掉，在細胞中大量的積累形成Aβ纖維沉積。幾乎所有的AD 患者腦細胞中都會出現(xiàn)不同程度的Aβ纖維沉積。胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)可以促進AD患者腦Aβ降解，在AD患者腦中IDE會隨年齡的增加而下降，而雌激素受體β的激活可以上調(diào)IDE的表達，從而減少Aβ的沉積。同時雌激素受體的激活可以抑制促凋亡蛋白Bim的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-w的含量，從而降低Aβ介導的神經(jīng)元毒性損傷[24]。同時，選擇性雌激素受體激動劑通過激活神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子快速內(nèi)流，引起絲裂原活化蛋白激酶信號傳導和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化，起到保護神經(jīng)的作用[25]；Caspase-3通過剪切靠近胞漿側(cè)C末端720位的天冬氨酸產(chǎn)生C末端異常的Aβ蛋白，這些蛋白對細胞有毒性作用，可誘導細胞凋亡[26]。另外，當早老素蛋白PS1和PS2基因突變和蛋白質(zhì)過度表達時，Caspase-3可以酶切上述蛋白產(chǎn)生異常的氨基酸C末端片斷，而這些片段可以促進APP水解產(chǎn)生更多Aβ，從而加速神經(jīng)元的凋亡[27]。PLAU基因可以編碼產(chǎn)生尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)，該因子與特異受體相結(jié)合，催化生成具有降解神經(jīng)毒性Aβ蛋白作用的纖溶酶。因此uPA及其受體與AD發(fā)病的關系越來越受到關注[28]；而HSPA8、CCNA2、LDHB 與AD的關系尚未見相關報道，或可成為潛在作用靶點。

KEGG通路富集分析共得到8條與AD相關的通路，分別是氨基糖和核苷酸糖代謝、氮代謝、AMPK信號通路、胰島素信號通路、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甲狀腺激素信號通路、細胞周期，以上通路均與代謝相關。在AD患者中，功能失調(diào)的下丘腦導致能量穩(wěn)態(tài)紊亂和隨之而來的代謝障礙。在改變的代謝途徑中，肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和病毒感染增加了患AD的風險。研究顯示，AD患者的神經(jīng)退行性表現(xiàn)與腦能量代謝紊亂有關[29]。研究顯示，在AMPKα2敲除的神經(jīng)元細胞中Aβ生成會增加。可能的機制是由于激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)后，調(diào)節(jié)APP生成進而減少Aβ的產(chǎn)生[30-31]。胰島素信號通路可以直接或間接地參與Aβ的清除過程。研究發(fā)現(xiàn)，人體出現(xiàn)胰島素抵抗時，升高的胰島素水平可以提高β分泌酶活性，從而加速APP剪切生成更多的Aβ蛋白。因此通過調(diào)節(jié)IDE的活性來抑制Aβ的生成[32]。

綜上，基于網(wǎng)絡藥理學方法對天麻素抗阿爾茲海默癥的潛在靶點進行了預測，并對潛在靶點進行了蛋白互作研究，以及通路富集分析。天麻素或可以作為治療AD的一個新的潛在化合物。同時本研究也具有一定的局限性，所得結(jié)論均建立于數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)絡藥理學技術，缺乏相關實驗的驗證。后期將繼續(xù)從其化合物結(jié)構(gòu)改造、藥效評價以及機制驗證等方向開展試驗，為其進一步深入研究提供思路和參考。