邱大東, 周梨萍, 郭文宇, 李俊剛, 2

（1.四川百善緣實(shí)業(yè)有限公司, 四川綿陽(yáng) 621000；2.綿陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川綿陽(yáng) 621000）

1 概述

1.1 酵素

酵素是指以一種或多種水果、新鮮蔬菜為原料, 經(jīng)酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等復(fù)合菌種發(fā)酵而成的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品, 現(xiàn)在酵素的英文名為“Jiaosu”。酵素被日本稱為“酶”“enzyme”, 具有催化功能[1-2]。

微生物酵素具有一定的功能性, 含有很多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 如礦物質(zhì)、維生素、酶等, 還具有抗菌防御、消炎、延緩衰老、抗感染和抗氧化去除自由基等功能[3-6]。

1.2 生姜及生姜酵素

生姜, 姜科姜屬植物, 是一種多年生的藥食同源的一種草本植物, 主要成分有揮發(fā)性的姜精油, 非揮發(fā)性的生姜多糖、生姜蛋白酶、姜辣素及一些二苯基庚烴類的物質(zhì)[7]。生姜具有抗腫瘤[8]、抗炎[9]、抑菌和抗氧化作用[10-11], 應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域、化妝品和食品領(lǐng)域。

生姜酵素是由生姜原汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成, 含有大量易被吸收的活性成分, 如姜辣素、姜油酮、姜烯酚、姜醇、多種維生素、蛋白酶、纖維素等。具有誘食、排毒、促進(jìn)消化道和抗氧化、抗衰老、防腐抑菌等作用。Ademosun Mary T等人[12]評(píng)估了生姜果汁飲料的抗氧化性能, 血糖指數(shù)和碳水化合物水解酶活性。Nadabe dos Santos Reis等人[13]小試規(guī)模水蒸氣蒸餾法提取生姜精油的色譜及微形態(tài)分析。周穎等人[14]探討生姜酵素復(fù)合菌發(fā)酵過(guò)程中生物活性成分含量及其抗氧化活性的變化。目前, 國(guó)內(nèi)外生姜酵素風(fēng)味物質(zhì)的研究報(bào)道較少, 市場(chǎng)未見(jiàn)生姜酵素產(chǎn)品流通。

試驗(yàn)以生姜原汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的生姜酵素為研究對(duì)象, 比較生姜原汁、生姜酵素發(fā)酵前后代謝產(chǎn)物變化情況, 為生姜的綜合性開發(fā)和生姜酵素功能性研究提供理論基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)原料

（1）生姜原汁。將生姜去除雜質(zhì), 用清水浸泡, 充分洗凈, 再用純凈水清洗, 切碎, 生姜∶水=1∶3打漿, 于80℃下滅菌15 min, 冷卻備用。

（2）生姜酵素。將滅菌后的生姜原汁放入發(fā)酵罐, 按5%接入乳酸菌復(fù)合菌液, 于37℃下恒溫發(fā)酵, 定時(shí)測(cè)定理化指標(biāo)。

2.1.2 主要器材

UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì), 上海美析儀器有限公司產(chǎn)品；SYC-B型電熱恒溫調(diào)速振蕩器, 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；FA3014N型電子天平, 上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；GCMS-QP2020型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀, 日本島津公司產(chǎn)品。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 風(fēng)味物質(zhì)的分離濃縮

準(zhǔn)確量取生姜原汁和生姜酵素各100 mL放入250 mL分液漏斗中, 加入無(wú)水乙醚50 mL, 劇烈振蕩多次, 加入約0.5 g氯化鈉, 靜置30 min待分層, 取上層清液, 加無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾。重復(fù)提取2次, 合并提取液, 于40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮減壓蒸餾, 最終得到約0.5 mL具有濃郁香氣的橘黃色溶液, 待進(jìn)樣。

2.2.2 色譜條件設(shè)定

（1）GC條件[15]。柱箱溫度為50℃, 進(jìn)樣口溫度230℃, 不分流進(jìn)樣, 進(jìn)樣時(shí)間1 min, He作為載氣, 流量控制方式為線速度, 壓力為53.5 kPa, 總流量為50.0 mL/min, 柱流量為1.00 mL/min, 線速度36.3 cm/sce, 吹掃流量為3.0 mL/min。色譜柱為SH-Rxi-SSil MS（30 m×0.25 mm, 0.25μm）, 升溫程序設(shè)置為50℃保持2 min, 以10℃/min的升溫速率升至230℃, 保持5 min。

（2）MS條件。離子源溫度為230℃, 接口溫度為250℃, 溶劑延遲時(shí)間為1.5 min, 使用儀器規(guī)定的電壓, 電子源。

（3）揮發(fā)性成分定性方法。采用GC-MS Postmm Analysis軟件完成, 未知化合物采用Wiley和NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索, 根據(jù)所得譜圖進(jìn)行匹配分析。與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比, 匹配度＞85%的鑒定結(jié)果才予以確認(rèn)。

（4）定量方法。采用面積歸一法, 將色譜圖中的共有峰面積值相加作為峰總面積, 然后用每個(gè)峰面積比上總面積即為該物質(zhì)的相對(duì)含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 生姜原汁、生姜酵素總離子色譜圖及總離子色譜對(duì)比圖

用GC-MS法測(cè)定后, 根據(jù)Wiley和NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索及對(duì)質(zhì)譜圖的峰進(jìn)行分析, 確定每種峰所代表的物質(zhì)。

GC-MS法測(cè)定生姜原液風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖見(jiàn)圖1, GC-MS法測(cè)定生姜酵素風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖見(jiàn)圖2, 風(fēng)味物質(zhì)總離子色譜對(duì)比圖見(jiàn)圖3。

圖1 GC-MS法測(cè)定生姜原液風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖

圖2 GC-MS法測(cè)定生姜酵素風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖

圖3 風(fēng)味物質(zhì)總離子色譜對(duì)比圖

由圖1～圖3可知, 生姜原液和生姜酵素的風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量有很大的差別。生姜原液中檢出66種風(fēng)味物質(zhì), 生姜酵素中檢出68種風(fēng)味物質(zhì), 生姜酵素中的風(fēng)味物質(zhì)比生姜原液多, 但是生姜原液中風(fēng)味物質(zhì)的含量較大, 峰面積普遍比生姜酵素的峰面積大。

3.2 生姜原汁、生姜酵素風(fēng)味物質(zhì)成分及含量

根據(jù)Wiley和NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索及對(duì)質(zhì)譜圖的峰進(jìn)行分析, 將所得的物質(zhì)的英文名字在CAS中檢索出其代表的物質(zhì)的中文名及其相對(duì)含量。

生姜原液和生姜酵素風(fēng)味物質(zhì)比較見(jiàn)表1。

表1 生姜原液和生姜酵素風(fēng)味物質(zhì)比較

由表1可知, 確定了生姜原液中的38種化學(xué)成分, 生姜酵素中的42種化學(xué)成分, 生姜原液中確定的成分占總成分的69.31%, 生姜酵素中確定的成分占總成分的76.94%, 在已鑒別的風(fēng)味物質(zhì)成分中, 生姜原液和生姜酵素中相同的風(fēng)味成分有18種, 其中含量最高的是崁烯和甲基庚烯酮, 但是在總成分中, 生姜原液中香芹酚的含量最高, 達(dá)到23.21%, 生姜酵素中桉葉油醇的含量占總成分的28.48%, 香芹酚具有抗氧化、抗炎、抗癌的作用, 在生姜酵素中未檢測(cè)到, 可能是生姜原汁經(jīng)益生菌發(fā)酵分解成為小分子化合物。桉葉油醇有樟腦氣息和清涼的草藥味道, 具有殺菌和殺蟲作用, 多用于醫(yī)藥和食品香料, 還常用作防腐劑。

生姜原液中檢測(cè)出來(lái)的風(fēng)味物質(zhì)主要有萜烯類、醛類、醇類、酯類、酮類、烴類等, 其中萜烯類化合物的占比較大, 萜烯類物質(zhì)通常是強(qiáng)顯味物質(zhì), 這類風(fēng)味物質(zhì)的存在使生姜具有了香辣的氣味。

生姜酵素中檢測(cè)出來(lái)的風(fēng)味物質(zhì)主要是單萜類、醇類、酯類等, 其中桉葉油醇是使生姜酵素帶有辛冷氣味的單萜類物質(zhì), 生姜酵素中還帶有香蕉或蘋果等水果香, 并有一定的刺激感和澀味, 這是酵素中的乳酸已酯和乙酸異戊酯等酯類風(fēng)味物質(zhì)呈現(xiàn)出來(lái)的。

蒎烯、β-水芹烯、正辛醛、鄰-異丙基苯、香芹酚、乙酰胺, 2-甲基-丙酸-1-甲基-1-(4-甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酯、香茅醛、香葉醇、反式-2-癸烯醛、檸檬醛、2-十一酮、2-十一醇6,6-二甲基雙環(huán)庚-2-烯-2-乙酸甲酯、β-石竹烯、6,10-二甲基-5,9-十一雙烯-2-酮、(+)-1,7-二表-β-雪松烯、佛術(shù)烯、大牛兒烯、α-法呢烯、反式-橙花叔醇這些物質(zhì)只在生姜原液中存在, 而在生姜酵素中并未檢出, 經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn), 未在生姜酵素中檢出的風(fēng)味物質(zhì)大多數(shù)是只溶于醇類等有機(jī)溶劑而不溶于水的, 這些風(fēng)味物質(zhì)都屬于大分子物質(zhì), 發(fā)酵過(guò)程中在微生物的作用下被分解成了小分子物質(zhì)。存在于生姜酵素中的風(fēng)味物質(zhì)則大多數(shù)是酯類, 在生姜酵素發(fā)酵過(guò)程中, 益生菌產(chǎn)生的酸與醇發(fā)生酯化反應(yīng), 就會(huì)生成酯類, 這也是發(fā)酵現(xiàn)象的表征。生姜原液中萜烯類物質(zhì)基本上代表了生姜的風(fēng)味特征, 雖然經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的莰烯、甲基庚烯酮、α-水芹烯、香茅醛、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯、(+)-環(huán)苜蓿烯、(-)-AlpHa-蒎烯的含量明顯下降, 但在發(fā)酵后的生姜酵素中仍保留下一些, 這些被保留下來(lái)的風(fēng)味物質(zhì)會(huì)使生姜酵素帶有生姜獨(dú)特的風(fēng)味。生姜酵素中的酯類和醇類占比較大, 使得酵素帶有發(fā)酵飲品獨(dú)特的醇香味和酒精的味道, 但更加柔和, 減少了辛辣味和刺激性。

4 結(jié)論

對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定采用直接頂空進(jìn)樣相比于劉金敏等人[15]使用的頂空固相微萃取方式進(jìn)樣而言, 直接頂空進(jìn)樣的試驗(yàn)步驟更簡(jiǎn)潔, 使用的儀器更少。在做風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)的前處理時(shí), 首先考慮的是用蒸餾萃取法將生姜原液和生姜酵素中的風(fēng)味物質(zhì)萃取出來(lái), 經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮, 得到濃縮液直接進(jìn)樣由氣質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行測(cè)定, 但是提取出來(lái)的濃縮液的風(fēng)味物質(zhì)損失過(guò)多, 之后采用的是直接頂空進(jìn)樣法對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的。

生姜中的化合物主要是揮發(fā)油、姜辣素和二苯基庚烷3種, 揮發(fā)油中的化合物主要是單萜烯類及其氧化物、倍單萜類及其氧化物, 姜辣素中主要是姜酚、姜烯酚等, 在生姜原液中檢測(cè)到的化合物主要是生姜中的揮發(fā)油成分, 如單萜類化合物崁烯, 受前處理方法和檢測(cè)方法的影響, 導(dǎo)致生姜原液的檢測(cè)結(jié)果與生姜本身的成分具有一定差異。