孫國偉 王麗潔 朱飛冀 胡彩珍 孫金陸 蘇靜娜 方菁嶷

1 蘇州蘇大衛(wèi)生與環(huán)境技術(shù)研究所有限公司 （江蘇 蘇州 215000）

2 蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院 （江蘇 蘇州 215000）

內(nèi)容提要：目的：對(duì)人類輔助生殖技術(shù)用液體類醫(yī)療器械的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化研究。方法：以該類醫(yī)療器械的典型代表—囊胚培養(yǎng)液為研究對(duì)象，根據(jù)其特點(diǎn)對(duì)其細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的劑量水平選擇、結(jié)果判定方式等進(jìn)行優(yōu)化，分析經(jīng)優(yōu)化后的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果：在經(jīng)優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)系統(tǒng)有效，試驗(yàn)結(jié)果為陰性且具有可重復(fù)性。結(jié)論：通過對(duì)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)劑量水平選擇、結(jié)果判定方式的優(yōu)化，可獲得更準(zhǔn)確、可靠的測試結(jié)果。

細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)是由Bruce N.Ames于1975年建立并不斷發(fā)展完善的一種用于測試致突變性的短期生物學(xué)試驗(yàn)。細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的主要原理為：利用是否能引起組氨酸營養(yǎng)缺陷型（His-）菌株（S.typhimurium或E.coli）的回復(fù)突變來判斷受試物是否具有潛在的致突變性[4,5]。由于該方法具有快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，是目前在化學(xué)品、藥品、醫(yī)療器械等諸多領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用的一種遺傳毒性初篩測試方法。由于ART液體器械具有組分復(fù)雜、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，使該類器械在進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)時(shí)極易對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用，從而影響試驗(yàn)有效性及最終測試結(jié)果的判讀。本文以ART液體器械的典型代表—囊胚培養(yǎng)液為例，對(duì)該類器械的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期為其遺傳毒性等安全性評(píng)價(jià)提供技術(shù)參考[6]。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試劑：生理鹽水（廣西裕源）；NaNH4HPO4·4H2O、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、NaCl、KCl、MgCl2·6H2O、葡萄糖、L-組氨酸、D-生物素（國藥）；檸檬酸、疊氮鈉（Alfa Aesar）；PBS緩沖液（HyClone）；瓊脂粉（Beyotime）；葡萄糖-6-磷酸鹽、9-氨基吖啶、2-硝基芴、2-氨基蒽（Sigma-Aldrich）；NADP（Biohonren）；苯并（a）芘（Aladdin）；絲裂霉素C（GLPBIO）；大鼠肝微粒體酶S9（Moltox）。

菌種：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium)TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535（Moltox）。

儀器設(shè)備：高壓滅菌器（上海博迅）；超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈）；生物安全柜（Haier Biomedical）；生化培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒）；分光光度計(jì)（Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

參照YY/T 0870.1分別配制S9-Mix、40%（W/V）葡萄糖溶液、Vogel-Bonner（VB）液、底層瓊脂培養(yǎng)基、頂層瓊脂培養(yǎng)基及陽性誘變劑。

1.2.2 菌懸液制備

將各試驗(yàn)菌株接種至NB培養(yǎng)基中，37?C靜置過夜，隨后37?C振蕩培養(yǎng)至獲得109cfu/mL的菌懸液。

病害防治。在茄子的生長中，其病害主要有茄苗猝倒病、立枯病、綿疫病和病毒病，針對(duì)這些病害要采取具體的措施進(jìn)行防治，一般采用用50%多菌靈可濕性粉劑每平方米苗床 8-10 g，與細(xì)土混勻，播種時(shí)下鋪上蓋，出苗后用75%百菌清可濕性粉劑六百倍液噴霧可防治猝倒病與立枯病菌；也可以用64%殺毒礬600倍液噴霧防治綿疫??；用維生素A120倍液噴霧，苗期2次，移栽后1次，可防治病毒病。

1.2.3 樣品制備

無菌操作，將囊胚培養(yǎng)液用生理鹽水分別稀釋為50%、25%、12.5%、5%四個(gè)濃度，共平行制備三份樣品，稀釋完成后立即用于試驗(yàn)（本研究共選取100%、50%、25%、12.5%、5%五個(gè)劑量水平）。

1.2.4 平板摻入流程

將頂層瓊脂培養(yǎng)基融化并保溫在45?C條件下，根據(jù)表1將各溶液加入頂層瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后注入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板使其分布均勻（每組三個(gè)平行）。待頂層瓊脂培養(yǎng)基凝固后，于37?C倒置培養(yǎng)72h。培養(yǎng)后，觀察背景菌苔生長情況，記錄每皿回復(fù)突變菌落數(shù)，以每皿回復(fù)突變菌落數(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

表1.組別設(shè)置(mL)

1.2.5 結(jié)果評(píng)估

使用SPSS Statistics 25對(duì)各組間的回復(fù)突變菌落數(shù)進(jìn)行差異性分析（t檢驗(yàn)），P<0.01（陽性對(duì)照與陰性對(duì)照比較）、P<0.05（試驗(yàn)組與陰性對(duì)照比較）即認(rèn)為存在顯著性差異。

試驗(yàn)菌懸液濃度應(yīng)≥109cfu/mL，背景菌苔應(yīng)生長良好；自發(fā)回復(fù)突變組回復(fù)突變菌落數(shù)應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)；陽性對(duì)照較陰性對(duì)照應(yīng)有顯著性增加且在實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)；滿足上述條件，試驗(yàn)系統(tǒng)方為有效。

不論在活化或非活化的試驗(yàn)系統(tǒng)下，試驗(yàn)組回復(fù)突變菌落數(shù)較對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照具有與劑量相關(guān)的增加，或至少在一個(gè)劑量水平，至少有一種試驗(yàn)菌株呈現(xiàn)出可重復(fù)的并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，且上述試驗(yàn)組回復(fù)突變菌落數(shù)超出了陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)范圍，即可判定為陽性結(jié)果；反之則判定為陰性結(jié)果[7,8]。

2.結(jié)果與分析

2.1 背景菌苔生長情況及回復(fù)突變菌落生長抑制性分析

背景菌苔生長情況[9]：與陰性對(duì)照相比，12.5%樣品的TA97a（+S9）和12.5%樣品的TA98（+S9）和100%樣品的TA1535（-S9）和100%、50%、25%樣品的TA1535（+S9）的背景菌苔顯著變薄，且背景菌落明顯增大，致使有肉眼可見的孤立菌落出現(xiàn)；100%、50%、25%樣品的TA97a（+S9）和TA98（+S9）有超過平皿面積90%的區(qū)域無背景菌苔產(chǎn)生；5%樣品的各菌種背景菌苔生長良好。

回復(fù)突變菌落生長抑制性：與陰性對(duì)照相比，100%樣品的TA102（-S9）回復(fù)突變菌落數(shù)的降低率超過50%，100%、50%、25%樣品的TA102（+S9）回復(fù)突變菌落數(shù)的降低率超過50%；12.5%、5%樣品各菌種每皿回復(fù)突變菌落數(shù)未出現(xiàn)上述情況。

通過對(duì)上述結(jié)果的綜合分析（見表2），排除對(duì)本試驗(yàn)系統(tǒng)具有細(xì)胞毒性或生長抑制性的劑量水平后，用于后續(xù)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果評(píng)估的劑量分別為：100%樣品的TA97a（-S9）、TA98（-S9）、TA100（+S9和-S9），50%樣品的TA102（-S9）、TA1535（-S9），12.5%樣品的TA102（+S9）、TA1535（+S9）及5%樣品的TA97a（+S9）、TA98（+S9）。

表2.背景菌苔生長情況及回復(fù)突變菌落生長抑制性分析

2.2 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果分析

試驗(yàn)菌懸液濃度為1.7×109cfu/mL，自發(fā)回復(fù)突變組回復(fù)突變菌落數(shù)均在實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。陽性對(duì)照回復(fù)突變菌落數(shù)較陰性對(duì)照具有顯著性增加（P<0.01）且在實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，差異性分析見表3。因此，本研究中的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)系統(tǒng)有效。

表3.回復(fù)突變菌落數(shù)的差異性分析(t檢驗(yàn))

與陰性對(duì)照相比，100%樣品的TA97a（-S9）、TA98（-S9）、TA100（+S9和-S9），50%樣品的TA102（-S9）、TA1535（-S9），12.5%樣品的TA102（+S9）、TA1535（+S9），5%樣品的TA97a（+S9）的回復(fù)突變菌落數(shù)均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異（P>0.05）；5%樣品的TA98（+S9）雖然存在顯著性差異（P<0.05），但其并未超出陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)范圍；故上述各組別的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均不符合“1.2.5結(jié)果評(píng)估”中關(guān)于陽性結(jié)果的評(píng)判要求，差異性分析見表3。

綜上所述：在本研究條件下，細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)系統(tǒng)有效，試驗(yàn)結(jié)果為陰性（無致突變作用），且試驗(yàn)結(jié)果具有可重復(fù)性（三份平行樣品的試驗(yàn)結(jié)果顯示出極高相似性，重復(fù)性數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)），說明本研究對(duì)該試驗(yàn)的優(yōu)化是行之有效的。

3.討論

3.1 ART液體器械細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)劑量水平選擇的優(yōu)化

ISO/TR 10993-33中規(guī)定：對(duì)于無細(xì)胞毒性的可溶受試樣品，在≥5μL/皿的劑量范圍內(nèi)選擇單一劑量水平進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)即可[7]。但由于多數(shù)ART液體器械均含有豐富的供配子和胚胎生長發(fā)育所必需的能量物質(zhì)（如氨基酸、葡萄糖、丙酮酸鹽等），受試樣品中大量的氨基酸和糖類等物質(zhì)會(huì)干擾細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的部分細(xì)菌體系，造成部分試驗(yàn)菌種的自發(fā)回復(fù)突變數(shù)量異常增多、背景菌苔生長異常等現(xiàn)象（過半數(shù)的組別在原液等其他高濃度時(shí)出現(xiàn)異常），從而導(dǎo)致整個(gè)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的失敗或測試結(jié)果誤判等[10]。因此，對(duì)于ART液體器械的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)來說，在不確定其氨基酸或糖類等物質(zhì)種類及含量的情況下，建議在≥5μL/皿的劑量范圍內(nèi)進(jìn)行多劑量水平試驗(yàn)（如本研究中的100%、50%、25%、12.5%、5%五劑量水平），以規(guī)避高濃度的氨基酸和糖類等物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)可能存在的干擾作用。

3.2 ART液體器械細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果判定方式的優(yōu)化

對(duì)于多劑量水平的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)來說，其結(jié)果判定的方式通常為：通過背景菌苔生長情況及回復(fù)突變菌落生長抑制性的分析，篩選出對(duì)所有試驗(yàn)菌株在各試驗(yàn)系統(tǒng)（+S9與-S9）下均無異常的劑量組別，隨后使用該劑量水平的測試數(shù)據(jù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行最終判定；但經(jīng)過對(duì)多種ART液體器械的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)上述常用的結(jié)果判定方式存在著較大缺陷，極易造成陽性結(jié)果漏判等情況。因此，建議對(duì)ART液體器械細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的結(jié)果采用分類、多重判定的方式來進(jìn)行（如2.1所述），這種分類判定的方式使得每種試驗(yàn)菌株的各試驗(yàn)系統(tǒng)均采用了對(duì)該組別試驗(yàn)無干擾作用的最大劑量水平進(jìn)行最終的結(jié)果判定，可以很好地避免陽性結(jié)果漏判情況，使結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。