安 軍

（海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司，海南?？?570100）

苦蕎麥具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有蛋白質(zhì)、生物類黃酮、多種維生素、纖維素和18種氨基酸等多種成分。此外，它還是一味藥用價(jià)值較高的中藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦蕎麥具有降血糖、降血脂、抗疲勞和增強(qiáng)免疫的功能，這都與其中所含的黃酮類化合物有關(guān)[1]。本文通過(guò)方法學(xué)相關(guān)系列實(shí)驗(yàn)，采用分光光度法對(duì)苦蕎酒中的總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，為苦蕎酒中總黃酮的相關(guān)研究提供參考[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器

電子天平XS205（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)TU-1810（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；超純水機(jī)MUL-9000（B）-1-10（南京總馨純水設(shè)備有限公司）；移液槍（200 μL、1000 μL、5 mL，上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）；渦旋混勻儀ZX4（意大利VELP）； 超聲波清洗器KQ-300VDB（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 溶液配制

①40%乙醇溶液。量取40 mL無(wú)水乙醇，定容至100 mL，混勻。②5%亞硝酸鈉溶液。稱取5.0 g亞硝酸鈉，用水溶解，定容至100 mL，混勻。③10%硝酸鋁溶液。稱取10.0 g硝酸鋁，用水溶解，定容至100 mL，混勻。④4%氫氧化鈉溶液。稱取4.0 g氫氧化鈉，用水溶解，定容至100 mL，混勻。⑤200 mg/L 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取10.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至 50 mL容量瓶中，加入40%乙醇溶液充分溶解后，定容、混勻。本方法中的水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

準(zhǔn)確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)11.13 mg（100080-201811， 92.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）于50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容并搖勻。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL置于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min，在波長(zhǎng)400～600 nm下進(jìn)行掃描，確定最佳吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 工作標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、 0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分別置于10 mL具塞比色管中，分別添加40%乙醇至1 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值，同時(shí)以40%乙醇為空白測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取苦蕎酒樣品1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量。

1.3.4 總黃酮含量的計(jì)算

總黃酮含量的計(jì)算公式為

式中：C為苦蕎酒中總黃酮的含量，μg/mL；A為樣品吸光度；X為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；B為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長(zhǎng)的確定

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法操作，最后搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于400～600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸收曲線。結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 顯色條件的優(yōu)化

2.2.1 總黃酮在不同溶劑中吸收情況

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于3個(gè)10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，最后搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值，詳見表1。結(jié)果表明，在相同實(shí)驗(yàn)條件下總黃酮在40%乙醇溶劑中吸光度最大。

表1 不同試劑的吸光度情況

2.2.2 顯色劑硝酸鋁濃度的選擇

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于5個(gè)10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入不同質(zhì)量濃度（2%、5%、10%、15%和20%）硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值，結(jié)果見表2。隨著硝酸鋁濃度的增加，吸光度快速增加，在濃度為10%時(shí)達(dá)到最大值，此后再增加濃度，吸光度值緩慢下降，因此選擇硝酸鋁濃度 為10%。

表2 不同硝酸鋁濃度吸光度情況

2.2.3 顯色劑硝酸鋁用量的選擇

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于5個(gè)10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入不同體積（0.1 mL、 0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL）10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值。如表3所示，隨著硝酸鋁使用量的增加，吸光度值迅速增大，在加入量0.3 mL時(shí)到達(dá)最大值，此后再增大加入量，吸光度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)并逐漸趨于穩(wěn)定，因此選擇硝酸鋁用量為0.3 mL。

表3 不同硝酸鋁用量吸光度情況

2.3 工作標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

按照1.3.2中的方法，得到回歸方程：Y=0.00133X+ 0.00121，其中斜率a=0.00133，截距b=0.00121，相關(guān)系數(shù)R=0.9999。由試驗(yàn)結(jié)果可知，蘆丁在0～ 205.682 μg呈良好的線性關(guān)系，詳見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)含量系列與相應(yīng)的吸光度

2.4 檢出限與測(cè)定下限

根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ 168—2020）[3]的技術(shù)要求，結(jié)合回歸方程Y=0.00133X+0.00121，可計(jì)算出檢出限為7.5 μg，測(cè)定下限為30 μg。

2.5 精密度

選取兩種苦蕎酒樣品，每份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法連續(xù)測(cè)定6次，詳見表5。結(jié)果顯示RSD值為3.54%，說(shuō)明該方法精密度高。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)兩種苦蕎酒經(jīng)顯色劑顯色后，其絡(luò)合物顏色分別為淡紅色和橙黃色。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性

取苦蕎酒樣品1.0 mL，按照1.3.2中的方法將樣品制備完成后，于不同時(shí)間測(cè)其吸光度，觀察2 h內(nèi)吸光度變化趨勢(shì)（見表6）。結(jié)果表明，該方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7 重復(fù)性

由兩名實(shí)驗(yàn)人員取兩種苦蕎酒樣品，每種6份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量（見表7）。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

表7 樣品重復(fù)性試驗(yàn)

2.8 加標(biāo)回收率

取兩種苦蕎酒樣品，按照1.3.2中的方法進(jìn)行加標(biāo)回收率檢測(cè)，平行測(cè)定3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的回收率為88.88%～98.28%，滿足分析要求（見表8）。

表8 樣品回收率試驗(yàn)

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、苦蕎酒經(jīng)顯色劑顯色后，其絡(luò)合物顏色分別為淡紅色和橙黃色，是由于黃酮類化合物泛指這種兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物，而黃酮類化合物的顏色根據(jù)中間吡喃環(huán)的不同氧化水平和兩側(cè)A、B環(huán)上連接的各種取代基而分為不同的黃酮類型[4-5]。只有物質(zhì)中含有鄰二酚羥基，并且鄰二酚羥基沒有取代基時(shí)，該法才在510 nm處有最大吸收。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可以得出，該方法能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)苦蕎酒中總黃酮的含量，操作簡(jiǎn)單，其精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等各項(xiàng)指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的分析檢測(cè)要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。