周 平 徐偉杰 臧 瑞 李友寬 武煜明

1.昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院解剖教研室，云南昆明 650600；2.云南省昭通市中醫(yī)醫(yī)院急診科，云南昭通 657000

腦卒中是一種高發(fā)病率及致殘率的急性腦血管疾病，其中約80%為缺血性腦卒中[1-2]，腦組織局部血流供應(yīng)完全中斷會導(dǎo)致細胞迅速死亡，使患者出現(xiàn)認知和運動功能障礙[3]。組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）是目前治療缺血性腦卒中的有效方法，但tPA 具有嚴格的適應(yīng)證和狹窄的窗口期，僅有5%的患者可以進行tPA 治療[4]。腦卒中核心區(qū)周圍的腦缺血半影區(qū)內(nèi)細胞凋亡和自噬并存，自噬將受損細胞器傳遞至溶酶體進行降解并產(chǎn)生能量[5-6]。本研究選擇大鼠左側(cè)大腦中動脈閉塞再灌注模型模擬缺血性腦卒中亞急性期，通過自噬誘導(dǎo)劑及抑制劑干預(yù)自噬活性探究神經(jīng)元自噬的相關(guān)機制[7]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取8 周齡250～280 g 的SPF 級雄性健康SD 大鼠96 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為：SCXK（湘）2019-0004；合格證號：No.430727210101005026。飼養(yǎng)于昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院（以下簡稱“我?！保嶒瀯游镏行?，并通過我校動物倫理委員會審批（R-062021LH-122）。

1.2 主要藥物與試劑

TTC 試劑（G3005）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0010）、RIPA 裂解液（P0013B）、電致化學(xué)發(fā)光試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈3（light chain 3，LC3）（83506）、Becline-1（3738）、β-actin（3700S）、神經(jīng)元核心抗原（neuronal nuclei，NeuN）一抗（ab104224）、山羊抗兔二抗（SA00001-2）、DAPI（4038）購自Cell Signaling Technology 公司；水合氯醛（A600288）、Triton X-100（T8200）購自北京索萊寶科技有限公司，配制SDS 溶液、電泳液、轉(zhuǎn)膜液。Alexa Fluor-488-綴合抗小鼠IgG（ab150077）、Alexa Fluor-594-綴合抗兔IgG（ab150080）購自美國abcam 公司。

1.3 動物分組及造模

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、雷帕霉素組、3-甲基腺嘌呤組，每組24 只。制備大鼠左側(cè)腦中動脈閉塞再灌注模型[8]，暴露大鼠左側(cè)頸內(nèi)、頸外及頸總動脈，經(jīng)頸外動脈切口插入4-0 尼龍線栓，經(jīng)頸內(nèi)動脈進入顱底到達大腦中動脈處（長度1.8～2.0 cm）頸外動脈遠端結(jié)扎固定并計時，激光多普勒血流儀檢測腦動脈血流中斷情況，90 min 后再灌注，以造模后Zea-longa 評分1～3 分為造模成功[9]。假手術(shù)組除不插入線栓外，其余各步驟均相同。

1.4 干預(yù)方法

10%水合氯醛麻醉后將大鼠俯臥固定于腦立體定位儀，于前囟后1.0 mm、中線左側(cè)1.5 mm、深3.8 mm的左側(cè)腦室留置給藥管，有腦脊液流出提示定位準(zhǔn)確。雷帕霉素組給予雷帕霉素（8 ng 溶解于5 μl 0.1%DMAO 中），3-甲基腺嘌呤組給予3-甲基腺嘌呤（100 μg溶解于5 μl 0.1%DMAO 中），假手術(shù)組、模型組給予5 μl 0.1%DMAO 溶液，四組給藥均經(jīng)側(cè)腦室泵入[10]。四組注射后留針5 min，1 次/d，連續(xù)7 d。

1.5 行為學(xué)評估

每組隨機選取6 只，根據(jù)改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）[11]分別從反射缺失或異常運動（0～4 分）、運動測試（0～6 分）、感覺實驗（0～2 分）、平衡木實驗（0～6 分）進行評分，得分越高表示大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.6 腦梗死體積檢測

行為學(xué)評估后，每組另取6 只完整大腦于-20°C冰箱中冷凍20 min 后沿冠狀面切成2 mm 厚的腦片，37°C 下TTC 染色30 min，4%多聚甲醛固定12 h 后拍照，未染色的白色區(qū)域為梗死區(qū)域。腦梗死體積占比（%）=腦梗死體積/同側(cè)半球體積×100%。

1.7 免疫熒光染色

每組另取6 只大鼠麻醉，取完整大腦于20%蔗糖溶液中脫水24 h。采用冷凍切片機將其切成20 μm厚的冠狀切片放于原位雜交保護液中。PBS 洗滌腦片后采用0.2%Triton X-100 透化15 min，10%BSA 封閉45 min 后將腦片分別與LC3（1∶400）和NeuN（1∶400）4℃過夜，與Alexa Fluor-488-綴合抗小鼠IgG（1∶800）和Alexa Fluor-594-綴合抗兔IgG（1∶800）于37℃避光孵育1 h，DAPI 溶液復(fù)染細胞核5 min，貼于載玻片并以抗熒光淬滅劑封片，高倍顯微鏡（400×）下拍照。

1.8 Western blot 檢測

每組剩余6 只大鼠取缺血半影區(qū)腦組織研磨勻漿后RIPA 緩沖液處理40 min。4℃下12 000 r/min 離心15 min 取上清液，離心半徑8 cm。SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，10%脫脂牛奶封閉2 h 后PBST 洗滌，再用LC3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）、Beclin-1 和β-actin（1∶1 000）-4℃孵育過夜。洗滌后，將膜與山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶酶標(biāo)抗體（1∶5 000）室溫下孵育1 h，與電致化學(xué)發(fā)光試劑結(jié)合后通過BIO-RAD系統(tǒng)曝光拍照，條帶的光密度通過Image J 軟件進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組神經(jīng)功能比較

模型組mNSS 高于假手術(shù)組，雷帕霉素組低于模型組，3-甲基腺嘌呤組高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖1。

圖1 四組神經(jīng)功能比較（n=6）

2.2 四組腦梗死體積占比比較

模型組腦梗死體積占比高于假手術(shù)組，雷帕霉素組低于模型組，3-甲基腺嘌呤組高于模型組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖2。

圖2 四組腦梗死體積占比比較（n=6）

2.3 四組腦缺血半影區(qū)自噬相關(guān)指標(biāo)表達比較

熒光染色及定量分析結(jié)果顯示，模型組LC3 陽性細胞占比高于假手術(shù)組，雷帕霉素組高于模型組，3-甲基腺嘌呤組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。Western blot 結(jié)果顯示，模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平高于假手術(shù)組，雷帕霉素組高于模型組，3-甲基腺嘌呤組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖4。

圖4 四組腦缺血半影區(qū)自噬相關(guān)指標(biāo)表達比較（n=6）

2.4 四組缺血半影區(qū)NeuN 陽性細胞占比比較

免疫熒光檢測及定量分析結(jié)果顯示，模型組缺血半影區(qū)NeuN 陽性細胞占比低于假手術(shù)組，雷帕霉素組高于模型組，3-甲基腺嘌呤組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖5。

3 討論

腦缺血發(fā)生后缺血半影區(qū)內(nèi)神經(jīng)細胞自噬被顯著激活[12]，但自噬是神經(jīng)元存活的一把雙刃劍，其神經(jīng)保護作用仍有爭議[13]。誘導(dǎo)適度自噬可增加神經(jīng)元存活率，改善腦缺血后神經(jīng)功能損傷，但抑制自噬則加重神經(jīng)元死亡[14-16]。但抑制缺血性腦卒中后的自噬發(fā)生也可減少腦缺血再灌注后的梗死體積，因此認為神經(jīng)元過度自噬將導(dǎo)致細胞死亡[17]。此結(jié)果可能由多種原因引起，包括腦缺血區(qū)域、缺血持續(xù)時間、干預(yù)藥物劑量的不同等[18-20]，其中藥物干預(yù)時間的不同可能是自噬活性差異的重要原因[21]。自噬發(fā)生后Beclin-1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可用于評估腦卒中后的自噬水平，LC3 前體分子裂解形成LC3-Ⅰ后被激活并偶聯(lián)，以LC3-Ⅱ的形式附著到自噬體膜，與Beclin-1 一同升高[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組缺血半影區(qū)Beclin-1 及LC3 均有較高表達水平，且該區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目減少，大鼠大腦大面積梗死并表現(xiàn)出一定程度的神經(jīng)缺損障礙。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素干預(yù)后該區(qū)域自噬水平增加，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤則出現(xiàn)相反結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，自噬誘導(dǎo)增加了大鼠腦缺血半影區(qū)神經(jīng)元存活，自噬抑制則表現(xiàn)出相反作用。這些結(jié)果提示，自噬誘導(dǎo)劑在左側(cè)大腦中動脈閉塞的亞急性期可提供神經(jīng)保護作用，但自噬抑制則加重神經(jīng)損傷。

綜上，大鼠缺血性腦卒中亞急性期可能存在自噬不足，適當(dāng)自噬激活有利于神經(jīng)修復(fù)，及時接受溶栓或手術(shù)治療的患者應(yīng)該在腦卒中后期可適當(dāng)誘導(dǎo)自噬[25]。相反，自噬抑制劑造成的自噬不足加重了腦缺血損傷及神經(jīng)功能障礙[26-27]。自噬激活可增加大鼠腦缺血再灌注亞急性期神經(jīng)保護，為臨床亞急性期缺血性腦卒中患者的治療提供一定理論基礎(chǔ)。