梁贊姜, 徐洋, 金洪娟, 黃溶溶, 向成

1溫州和平整形醫(yī)院整形美容外科(浙江溫州 325000)； 2廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院思明院區(qū)醫(yī)療美容科(福建廈門 361000); 3吉林大學(xué)第一醫(yī)院整形外科(吉林長春 137000)

燒傷患者創(chuàng)面愈合后會形成增生性瘢痕，是一種皮膚纖維化疾病，主要表現(xiàn)為表面隆起呈紅色、缺乏彈性、局部增厚或癢痛等[1]。增生性瘢痕患者細(xì)胞外基質(zhì)如膠原纖維等過度生成、沉積，膠原排列紊亂，最終導(dǎo)致真皮纖維化，不僅影響美觀，還可能引起肢體、器官功能受限，危害患者身心健康，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降[2-3]。臨床上如何有效預(yù)防及治療瘢痕，已成為目前國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)能夠促進(jìn)瘢痕形成，其在創(chuàng)面愈合過程中參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的生長、代謝，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖、刺激結(jié)締組織再生，可能在傷口愈合最后階段發(fā)揮作用[4]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)被認(rèn)為是一種多效性分子，在不同病理生理?xiàng)l件下發(fā)揮多種生物學(xué)作用，研究發(fā)現(xiàn)，其在傷口愈合過程中可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及趨化免疫細(xì)胞向傷口移動，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)[5]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)及放射免疫法檢測瘢痕組織中NGF、IGF1 mRNA及蛋白水平，探究NGF及IGF1在燒傷后增生性瘢痕組織中的表達(dá)情況及臨床意義，旨在為尋找新的臨床治療靶點(diǎn)提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取溫州和平整形醫(yī)院、廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院思明院區(qū)及吉林大學(xué)第一醫(yī)院2017年3月至2021年5月期間收治的增生性瘢痕患者114例為研究對象，所有患者均行手術(shù)治療。其中男59例，女55例，年齡15～53歲，平均(36.40±10.60)歲，頸面部29例，上肢34例，下肢9例，軀干42例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)表現(xiàn)為瘢痕隆起，紅色，伴有瘙癢、疼痛；(2)藥物治療或物理療法12個(gè)月無效者；(3)術(shù)前未經(jīng)藥物、放射、激光等治療；(4)患者均知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并惡變者；(2)合并瘢痕疙瘩；(3)合并其他皮損者；(4)妊娠或哺乳期女性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過(批準(zhǔn)號：2017007)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 術(shù)中留取患者增生性瘢痕組織作為瘢痕組，留取鄰近正常皮膚組織作為對照組，新鮮的組織標(biāo)本經(jīng)DEPC水處理后，置于無菌EP管中，液氮中速凍，并于-80℃保存。

1.2.2 qRT-PCR法檢測組織中NGF、IGF1 mRNA及相關(guān)炎性因子水平 取組織樣本，研磨為組織勻漿，采用TRIzol試劑提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：4897030001，瑞士羅氏公司)將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)。在Quant Studio5熒光定量PCR儀(貨號：V514732，美國賽默飛世爾科技公司)上進(jìn)行反應(yīng)，NGF、IGF1 mRNA及炎性因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6及IL-8 mRNA相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。NGF、IGF1、上述炎性因子及內(nèi)參β-actin引物序列詳見表1。

1.2.3 放射免疫法檢測組織中NGF、IGF1蛋白水平 組織樣本制備成為勻漿，調(diào)整pH值至3.0～4.0，加入重蒸餾乙酸乙酯提取上清，負(fù)壓抽干。采用放射免疫法檢測NGF、IGF1蛋白水平，試劑藥盒均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室提供。將NGF、IGF1標(biāo)準(zhǔn)品分別制備成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，采用順序飽和加樣法測定NGF、IGF1標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算結(jié)合率(B/B0)×100%，并以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，不同濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)濃度，換算為NGF、IGF1在組織內(nèi)的含量。

1.2.4 增生性瘢痕組織評價(jià)及瘢痕形成時(shí)間統(tǒng)計(jì) 采用溫哥華瘢痕量表(Vancouver Scar Scale，VSS)分別從色澤、厚度、柔軟度、血管分布等方面對患者瘢痕組織進(jìn)行評價(jià)，總分15分，分?jǐn)?shù)越高表示瘢痕越嚴(yán)重。

采用跨皮水分丟失(transepidermal water loss，TEWL)[6]評估增生性瘢痕的表皮屏障功能。在患者清醒安靜狀態(tài)下，于無陽光直射、不通風(fēng)、24～26℃環(huán)境下測量TEWL值。測量瘢痕TEWL值，以瘢痕鄰近正常皮膚為對照，計(jì)算增生性瘢痕TEWL凈喪失量(瘢痕TEWL值與對照皮膚TEWL的差值)。增生性瘢痕表皮功能障礙程度以TEWL凈喪失量來衡量。另統(tǒng)計(jì)患者瘢痕形成時(shí)間。

1.2.5 隨訪 對114例術(shù)后患者進(jìn)行隨訪，共隨訪6個(gè)月，結(jié)束時(shí)間為2021年11月30日，統(tǒng)計(jì)患者復(fù)發(fā)情況，根據(jù)患者是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組(36例)和未復(fù)發(fā)組(78例)。

2 結(jié)果

2.1 增生性瘢痕組織與正常皮膚組織HE染色比較 HE染色結(jié)果顯示，增生性瘢痕組織膠原纖維排列紊亂，存在大量成纖維細(xì)胞；正常皮膚組織膠原纖維排列疏松，存在少量成纖維細(xì)胞。見圖1。

注：A:增生性瘢痕組織;B:正常皮膚組織

2.2 兩組NGF、IGF1 mRNA及炎性因子水平比較 瘢痕組NGF、IGF1 mRNA水平及炎性因子MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平均高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組NGF、IGF1 mRNA及炎性因子水平比較

2.3 兩組NGF、IGF1蛋白水平比較 瘢痕組中NGF、IGF1蛋白水平均高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組NGF、IGF1蛋白水平比較

2.4 未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組NGF、IGF1蛋白水平比較 復(fù)發(fā)組中NGF、IGF1蛋白水平均高于未復(fù)發(fā)組(P<0.05)，見表4。

表4 未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組NGF、IGF1蛋白水平比較

2.5 增生性瘢痕組織評價(jià)及瘢痕形成時(shí)間分析 患者增生性瘢痕組織VSS量表評分為(11.47±2.35)分，瘢痕形成時(shí)間為(57.32±18.64)d；增生性瘢痕組織TEWL值為(13.74±3.11)g/(m2·h)，正常皮膚組織TEWL值為(6.32±2.28)g/(m2·h)，增生性瘢痕組織TEWL值明顯高于正常皮膚組織(t=20.544，P=0.000)，TEWL凈喪失量為(7.42±2.03)g/(m2·h)。

2.6 NGF、IGF1水平與炎性因子的相關(guān)性 瘢痕組織中NGF mRNA、IGF1mRNA表達(dá)均分別與MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 NGF、IGF1水平與炎性因子的相關(guān)性分析

2.7 NGF、IGF1水平與VSS量表評分、TEWL凈喪失量、瘢痕形成時(shí)間的相關(guān)性 瘢痕組織中NGF蛋白水平與VSS量表評分、TEWL凈喪失量、瘢痕形成時(shí)間均呈正相關(guān)(r=0.406、0.320，P=0.000、0.001)，見圖2～4；瘢痕組織中IGF1蛋白水平與VSS量表評分、TEWL凈喪失量、瘢痕形成時(shí)間均呈正相關(guān)(r=0.352、0.439，P=0.000、0.000)，見圖5～7。此外，瘢痕組織中NGF蛋白水平與IGF1蛋白水平也呈正相關(guān)(r=0.382，P=0.000)，見圖8。

圖2 NGF水平與VSS量表評分相關(guān)性圖

圖3 NGF水平與TEWL凈喪失量相關(guān)性圖

圖4 NGF水平與瘢痕形成時(shí)間相關(guān)性圖

圖5 IGF1水平與VSS量表評分相關(guān)性圖

圖6 IGF1水平與TEWL凈喪失量相關(guān)性圖

圖7 IGF1水平與瘢痕形成時(shí)間相關(guān)性圖

圖8 瘢痕組織IGF1水平與NGF水平的相關(guān)性圖

3 討論

燒傷后，皮膚創(chuàng)面愈合會經(jīng)歷炎性反應(yīng)、組織增生及組織改建3個(gè)階段，任一階段異常均可能造成增生性瘢痕，研究發(fā)現(xiàn)，燒傷患者增生性瘢痕發(fā)病率高達(dá)70%，患者常伴有瘢痕、瘙癢、攣縮和疼痛等癥狀，大面積燒傷還可能會導(dǎo)致患者運(yùn)動受限，嚴(yán)重影響患者正常生活[7]。近年來，手術(shù)、類固醇注射、放射治療等方式已成為治療增生性瘢痕的主要手段，但治療效果仍不夠理想。因此，深入探討增生性瘢痕發(fā)生機(jī)制，對尋找更佳的治療手段意義重大[8]。

增生性瘢痕形成過程中，炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞異常增殖，并大量分泌細(xì)胞因子和膠原纖維，導(dǎo)致肉芽組織增生，與此同時(shí)，部分細(xì)胞因子抑制細(xì)胞修復(fù)，引起瘢痕的增生性變化[9]。IGF1在傷口愈合早期表達(dá)量明顯增加，在傷口愈合過程中發(fā)揮重要作用，可介導(dǎo)生長激素合成與分泌，并直接作用于真皮成纖維細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂以及成骨細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白[10]。目前普遍認(rèn)為，長期炎癥狀態(tài)及膠原蛋白過度積聚可促進(jìn)增生性瘢痕的形成。Hazarika等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在體外，IGF1可刺激皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，且呈劑量、時(shí)間依賴方式。上皮細(xì)胞中的IGF1可在傷口愈合過程中促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的有絲分裂和纖維化，從而導(dǎo)致增生性瘢痕形成[12]。本研究結(jié)果顯示，增生性瘢痕組織中IGF1 mRNA及蛋白水平均高于正常皮膚組織，且與MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子呈正相關(guān)，結(jié)合上述研究推測，IGF1可能通過抑制成纖維細(xì)胞凋亡、促進(jìn)膠原合成、影響皮膚炎癥狀態(tài)等方式，參與增生性瘢痕形成過程[13]。

NGF是重要的神經(jīng)系統(tǒng)生物活性分子，不僅可加速創(chuàng)面神經(jīng)纖維再生，還可調(diào)節(jié)造血、免疫等過程，并通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的活性及功能加速創(chuàng)面愈合，且在創(chuàng)傷后局部疼痛中起重要作用[14]。NGF可由多種細(xì)胞如修復(fù)細(xì)胞、炎性細(xì)胞等分泌合成，與創(chuàng)傷修復(fù)關(guān)系密切。機(jī)體軟組織受創(chuàng)發(fā)生局部炎癥反應(yīng)后，膠原蛋白、血管母細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞等出現(xiàn)增生，局部血運(yùn)增加，NGF可在上述過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用[15]。本研究結(jié)果顯示，增生性瘢痕組織中NGF mRNA及蛋白表達(dá)均上升，且與炎性因子MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-8均呈正相關(guān)，推測其可能通過趨化、活化炎性細(xì)胞啟動創(chuàng)傷部位的膠原代謝，引發(fā)膠原過度積累，在加速創(chuàng)面愈合的同時(shí)，導(dǎo)致增生性瘢痕發(fā)生[16]。

VSS是臨床常用的瘢痕評價(jià)方法，本研究的相關(guān)性結(jié)果顯示，增生性瘢痕組織IGF1、NGF蛋白水平與VSS評分均呈正相關(guān)，提示IGF1、NGF可通過刺激膠原蛋白、膠原纖維過度增生，引起細(xì)胞外機(jī)制穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致瘢痕形成[17]。表皮屏障功能與維持皮膚穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，一旦損傷發(fā)生，表皮可非常敏感地感應(yīng)到損傷，并快速恢復(fù)屏障功能，啟動保護(hù)性免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)表皮炎癥狀態(tài)，恢復(fù)屏障功能，控制真皮瘢痕的形成。因此，在瘢痕的演變過程中，新生上皮屏障功能發(fā)揮重要作用，臨床上可通過改善皮膚屏障功能預(yù)防增生性瘢痕[18]。本研究中，增生性瘢痕組織中TEWL值高于正常皮膚組織，提示增生性瘢痕組織皮膚干躁、水分蒸發(fā)較多，存在皮膚屏障功能障礙[19]。且增生性瘢痕組織IGF1、NGF蛋白水平與TEWL凈喪失量均呈正相關(guān)，表明IGF1、NGF水平與皮膚屏障功能障礙有關(guān)，兩者有望成為評價(jià)瘢痕預(yù)后的指標(biāo)以及治療增生性瘢痕的新靶點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕組織IGF1、NGF蛋白水平與瘢痕形成時(shí)間均呈正相關(guān)，提示IGF1、NGF水平與傷口愈合時(shí)間有關(guān)，檢測兩者水平可能有利于早期評估瘢痕形成及預(yù)后情況。此外，增生性瘢痕組織中IGF1與NGF水平呈正相關(guān)，猜測兩者可能通過影響創(chuàng)傷部位的炎癥反應(yīng)以及膠原代謝，共同影響增生性瘢痕的發(fā)生。此外，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組中NGF、IGF1蛋白水平均高于未復(fù)發(fā)組，提示NGF、IGF1水平升高可能與增生性瘢痕術(shù)后復(fù)發(fā)有一定關(guān)系。

綜上所述，增生性瘢痕組織中NGF、IGF1 mRNA及蛋白水平均升高，且兩者與炎性因子、瘢痕狀態(tài)、表皮屏障功能、瘢痕形成時(shí)間及患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，有望成為臨床干預(yù)瘢痕的新治療靶點(diǎn)。但本研究僅隨訪6個(gè)月，NGF、IGF1水平與增生性瘢痕患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系需增加樣本進(jìn)行驗(yàn)證，另NGF、IGF1是否能夠應(yīng)用于增生性瘢痕的臨床治療，仍需進(jìn)行大量的動物研究及臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：梁贊姜、金洪娟和徐洋負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、實(shí)施、采集分析數(shù)據(jù)和論文撰寫以及研究經(jīng)費(fèi)的獲取，行政、技術(shù)或材料支持等，黃溶溶、向成負(fù)責(zé)資料收集、數(shù)據(jù)分析及其他工作支持。