王暢, 王宏偉, 馬釗, 熊輝

南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 1超聲醫(yī)學(xué)科， 2甲狀腺乳腺外科(河南南陽(yáng) 473000)

甲狀腺結(jié)節(jié)是一種臨床常見(jiàn)病，近年來(lái)檢出率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，有調(diào)查顯示[1]，普通人群中4%～7%可能會(huì)觸診甲狀腺結(jié)節(jié)，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)病率更是高達(dá)30%～67%。該病腫塊位于甲狀腺內(nèi)，且伴隨吞咽在甲狀腺內(nèi)隨之上下移動(dòng)，多因多種病因而引發(fā)，常見(jiàn)于女性[2]。盡管大部分甲狀腺結(jié)節(jié)屬于良性，但仍有20%左右的概率是惡性腫瘤[3]。因此，甲狀腺結(jié)節(jié)診治的關(guān)鍵是鑒別良惡性，鑒別診斷方法的準(zhǔn)確性及高效性極為重要[4]。常規(guī)超聲作為鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的有效手段，可通過(guò)觀察結(jié)節(jié)的回聲、邊緣、形態(tài)等方面進(jìn)行評(píng)估，但許多患者在接受檢查時(shí)常受本身主觀及儀器因素的影響，而導(dǎo)致診斷結(jié)果存在誤差[5]。近年來(lái)，超聲造影(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)在鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，其定量分析可避免由受檢者本身主觀原因及儀器條件帶來(lái)的誤差[6]。miRNA是一種含19～23個(gè)堿基的非編碼的小分子RNA，它能夠從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，如降解mRNA、抑制蛋白翻譯等[7]。有不少研究發(fā)現(xiàn)，miR-211能調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的遷移能力，在不同的細(xì)胞類(lèi)型中，miR-211通過(guò)調(diào)控不同的靶基因，來(lái)發(fā)揮相應(yīng)的作用[8-9]。miR-211在甲狀腺結(jié)節(jié)中的研究較少，因此，本研究對(duì)CEUS檢查與血清miR-211水平在甲狀腺結(jié)節(jié)中的鑒別診斷價(jià)值進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2021年3月在本院進(jìn)行檢查的260例甲狀腺結(jié)節(jié)患者為研究對(duì)象，男88例，女172例，平均年齡為(51.78±8.13)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次發(fā)病并確診，未經(jīng)治療；(2)所有受試者均通過(guò)病理檢查，以病理結(jié)果為診斷金標(biāo)準(zhǔn)；(3)患者及家屬均知情同意；(4)均接受CEUS檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并亞臨床甲狀腺功能減退及臨床甲狀腺功能減退者；(2)合并其他內(nèi)分泌及自身免疫性疾病患者；(3)身體狀況較差的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)(編號(hào)：2020-LW-09)。

1.2 研究方法

1.2.1 常規(guī)超聲與CEUS檢查 常規(guī)超聲檢查：患者平臥，頸后部適度墊枕，充分暴露頸前部甲狀腺區(qū)域；使用常規(guī)二維超聲獲得結(jié)節(jié)所在部位、大小、形態(tài)、數(shù)量、邊界及內(nèi)部回聲等信息，并留取圖像。CEUS檢查：采用PHILIPS iU22超聲診斷儀，L9-3探頭及頻率5～10 MHz進(jìn)行CEUS檢查。造影劑選用SonoVue(意大利Bracco公司)，使用時(shí)取25 mg溶解于5 mL生理鹽水，即為造影劑溶液，推注造影劑溶液(每次用量為1.5 mL)至肘部淺靜脈，同時(shí)按下計(jì)時(shí)鍵，持續(xù)采集至少120 s的動(dòng)態(tài)圖像，并存儲(chǔ)于硬盤(pán)中。

圖像分析：采用TOMTEC公司的SonoLiver CAP軟件勾畫(huà)正常甲狀腺組織及結(jié)節(jié)邊緣、中心顯像最強(qiáng)區(qū)的感興趣區(qū)，繪制時(shí)間強(qiáng)度曲線并獲取CEUS定量參數(shù)，包括達(dá)峰時(shí)間(TTP)、平均渡越時(shí)間(MTT)、上升時(shí)間(RT)及曲線下面積(AUCCEUS)。

1.2.2 血清標(biāo)本采集 所有患者均于入院第2天清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽血，每例5 mL，3 000 r/min離心10 min后，將血清吸至潔凈的離心管中，再離心10 min，完全除去血細(xì)胞成分后置于-80℃低溫冰箱保存。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)血清miR-211水平 按照RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取血清中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用特異性引物和SYBR Prellix Ex TaqTM實(shí)時(shí)PCR試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s變性、55℃ 30 s退火、72℃ 90 s延伸，共40個(gè)循環(huán)。以U6作為miR-211表達(dá)的內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-211的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 病理和影像結(jié)果 由病理結(jié)果得到，有44例患者檢測(cè)到甲狀腺結(jié)節(jié)惡性，為惡性組；有216例患者僅檢測(cè)到甲狀腺結(jié)節(jié)良性，為良性組。甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)超聲圖見(jiàn)圖1、2。

注：男性，57歲，左側(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)。A：常規(guī)超聲檢查顯示結(jié)節(jié)大小約7 mm，一點(diǎn)低回聲，邊緣不規(guī)則；B：CEUS檢查顯示無(wú)強(qiáng)化，形態(tài)不規(guī)則

注：女性，41歲，右側(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)。A：常規(guī)超聲檢查顯示結(jié)節(jié)大小約8.6 mm，明顯低回聲，邊緣不規(guī)則，有點(diǎn)狀回聲灶；B：CEUS檢查顯示低增強(qiáng)、邊界不清、形態(tài)不規(guī)則和異質(zhì)性增強(qiáng)，為甲狀腺乳頭狀癌

2.2 兩組間CEUS定量參數(shù)比較 兩組CEUS定量參數(shù)TTP、RT比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；惡性組患者CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS均明顯少于良性組(P<0.05)。見(jiàn)表2及圖3、4。

表2 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)CEUS定量參數(shù)比較

注：女性，46歲，左側(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)，MTT為50.88 s，AUCCEUS為1 723.59 %s

注：女性，53歲，右側(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)，MTT為31.05 s，AUCCEUS為941.63 %s

2.3 兩組間血清miR-211水平比較 惡性組患者血清miR-211水平明顯高于良性組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 血清miR-211水平比較

2.4 CEUS定量參數(shù)、miR-211單獨(dú)及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別診斷 ROC預(yù)測(cè)CEUS定量參數(shù)(MTT、AUCCEUS)、血清miR-211水平對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，CEUS定量參數(shù)MTT對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的AUCROC為0.786，敏感度為70.5%，特異度為79.6%，95%CI為0.701～0.871；CEUS定量參數(shù)AUCCEUS對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的AUCROC為0.840，敏感度為79.5%，特異度為80.6%，95%CI為0.772～0.908；血清miR-211水平對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的AUCROC為0.751，敏感度為88.9%，特異度為59.1%，95%CI為0.659～0.843；CEUS定量參數(shù)(MTT、AUCCEUS)與miR-211聯(lián)合鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的AUCROC為0.928，敏感度為77.8%，特異度為95.4%，95%CI為0.886～0.970。見(jiàn)表4、圖5。

表4 CEUS定量參數(shù)與血清miR-211水平對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別診斷價(jià)值

圖5 CEUS定量參數(shù)與血清miR-211水平鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的ROC曲線

3 討論

甲狀腺結(jié)節(jié)是由遺傳、環(huán)境等多因素導(dǎo)致的甲狀腺內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)異常的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，是臨床最常見(jiàn)的甲狀腺疾病[10]。甲狀腺結(jié)節(jié)可單發(fā)、可多發(fā)，多發(fā)結(jié)節(jié)的發(fā)病率較高。且大多數(shù)患者無(wú)自覺(jué)癥狀，因此，甲狀腺結(jié)節(jié)的觸診漏診率較高，多由健康體檢超聲檢查發(fā)現(xiàn)[11]。有調(diào)查顯示[12]，近年來(lái)，隨著社會(huì)環(huán)境、生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)的變化，甲狀腺結(jié)節(jié)的患病率逐年上升，我國(guó)甲狀腺結(jié)節(jié)平均檢出率明顯升高。雙功超聲掃查普遍應(yīng)用于臨床工作中甲狀腺結(jié)節(jié)的早期篩查與良惡性結(jié)節(jié)的鑒別診斷[13]。但常規(guī)超聲圖像中良性結(jié)節(jié)與惡性結(jié)節(jié)存在一定程度的相似性，對(duì)于良惡性結(jié)節(jié)的鑒別存在一定局限性[14]。因此，尋找新的鑒別診斷指標(biāo)十分關(guān)鍵。

近年來(lái)，隨著造影劑SonoVue的發(fā)展并在CEUS檢查中廣泛應(yīng)用，臨床醫(yī)生更容易觀察到甲狀腺結(jié)節(jié)內(nèi)血管分布及血流灌注情況，可作為常規(guī)超聲的輔助診斷[15]。CEUS操作方便、無(wú)輻射，可通過(guò)對(duì)比增強(qiáng)顯像，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察甲狀腺周?chē)⒀h(huán)情況，較常規(guī)超聲能更直觀的反映腫瘤血管的走行和分布，同時(shí)CEUS定量參數(shù)能客觀評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性[16]。施燕蕓等[17]研究結(jié)果表明，觀察CEUS定量參數(shù)AUCCEUS有利于區(qū)別甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)，CEUS可彌補(bǔ)常規(guī)超聲的不足為甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的診斷提供更多有利信息。本研究結(jié)果顯示，惡性組患者CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS均明顯低于良性組，與施燕蕓等[17]研究相似，提示CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS與甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性有一定關(guān)系。進(jìn)一步采用CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS的數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC分析，結(jié)果顯示，CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的AUCROC分別為0.786、0.840，敏感度分別為70.5%、79.5%，特異度為分別為79.6%、80.6%，提示檢測(cè)CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS能夠在一定程度上為甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行鑒別診斷提供依據(jù)。

miR-211是miRNA家族中位于人類(lèi)染色體Xp11.3位置的成員，miR-211分子結(jié)構(gòu)較短，穩(wěn)定性較高，能夠識(shí)別轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的惡性腫瘤組織的來(lái)源[18]。大量研究均發(fā)現(xiàn)，miR-211在許多實(shí)體惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，如在乳腺癌、胃癌、原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌及卵巢癌等惡性腫瘤組織中為高表達(dá)，即miR-211發(fā)揮促癌基因的功能[19-21]。但也有研究表明，miR-211在宮頸癌及腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中呈低表達(dá)，即發(fā)揮抑癌基因的功能[22-23]。研究表明miR-211在不同組織及疾病中發(fā)揮不同作用，而其在甲狀腺結(jié)節(jié)中的研究較少。因此，本研究對(duì)miR-211在甲狀腺結(jié)節(jié)中的表達(dá)及其鑒別診斷價(jià)值進(jìn)行了探究，結(jié)果顯示，惡性組甲狀腺結(jié)節(jié)患者血清中miR-211水平顯著高于良性組患者血清中表達(dá)，猜測(cè)血清miR-211水平可能能部分反映甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性。另ROC結(jié)果顯示，血清miR-211水平對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的AUCROC為0.751，敏感度為88.9%，特異度為59.1%；miR-211與CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS聯(lián)合鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的AUCROC為0.928，敏感度為77.8%，特異度為95.4%。提示血清miR-211水平能夠作為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的生物學(xué)指標(biāo)，且CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS與miR-211水平聯(lián)合診斷的AUCROC和特異度相對(duì)較高，對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別具有良好的診斷價(jià)值，更有利于為甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別診斷提供依據(jù)。

綜上所述，CEUS定量參數(shù)MTT在惡性組明顯縮短，AUCCEUS在惡性組明顯減少，miR-211在惡性組顯著高表達(dá)，CEUS定量參數(shù)MTT、AUCCEUS聯(lián)合miR-211對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別具有更好的診斷價(jià)值。

利益相關(guān)聲明：本研究不存在有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：王暢負(fù)責(zé)提出研究選題、設(shè)計(jì)方案、獲取經(jīng)費(fèi)、技術(shù)或材料支持，實(shí)施研究過(guò)程，采集整理數(shù)據(jù)，起草論文；王宏偉給予指導(dǎo)性支持；馬釗負(fù)責(zé)配合整理數(shù)據(jù)、完善分析數(shù)據(jù)、整理文獻(xiàn)；熊輝負(fù)責(zé)修改論文。