劉龍陽, 張麗華, 莊晨玉, 于彩崎, 紀娜, 羅立梅, 曾朝陽

南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦科(廣東廣州 510315)

排卵障礙相關(guān)的子宮異常出血(abnormal uterine bleeding-ovulatory dysfunction，簡稱AUB-O)多發(fā)生于青春期及絕經(jīng)前期，約占AUB的80%～90%?，F(xiàn)代醫(yī)學認為該類疾病的主要病機為調(diào)控生殖的下丘腦(H)-垂體(P)-卵巢(O) 軸(簡稱HPO軸)初建不成熟或功能紊亂，從而引起內(nèi)分泌失調(diào)導致子宮異常出血，是女性常見疾病之一[1-4]。而中醫(yī)學[5]認為本病的主要發(fā)病機制是沖任損傷，不能制約經(jīng)血，多見于少女先天稟賦不足，天癸初至，腎氣雅弱，腎陽不足，沖任未充；或大病久病，損及于腎。治療上以補腎固沖止血為法。目前，AUB-O的治療在西醫(yī)方面主要用性激素、人工周期等建立HPO軸正常反饋功能的方法，但存在藥物不良反應較大及停藥后恢復排卵率低且復發(fā)率高等不足。與西藥相比，中醫(yī)藥治療AUB-O的不良反應甚少，且治療結(jié)束后復發(fā)率低，故近年來中醫(yī)藥治療該類疾病的運用越來越多[6]。其中針藥合用治療AUB-O也已有相關(guān)報道，但究其治療的具體機制研究不深入。眾所周知，排卵主要與卵巢顆粒細胞有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是一種多效能的細胞因子，參與了卵巢顆粒細胞增殖和卵母細胞成熟等生理過程，并可調(diào)節(jié)數(shù)種關(guān)鍵的顆粒細胞酶，對保持理想的卵巢內(nèi)環(huán)境發(fā)揮著重要的作用[7]。卵巢局部的TGF-β1水平異?？蓪е侣雅莅l(fā)育異常和排卵障礙。因此，檢測此通路中的相關(guān)指標，對于研究卵巢顆粒細胞形態(tài)學改變的具體機制具有重大的意義。近年來，針刺、中藥在促排卵、調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞增殖與凋亡，以及在改善HPO軸的內(nèi)分泌功能已有研究報道[8-9]。盡管如此，目前關(guān)于針藥合用治療腎虛型排卵障礙大鼠卵巢顆粒細胞形態(tài)學改變的具體機制尚未見報道。2017年10月至2019年8月本研究從TGF-β1信號通路的表達情況探究針藥合用對腎虛型排卵功能障礙大鼠卵巢顆粒細胞形態(tài)學改變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD雌性大鼠40日齡80只。飼養(yǎng)于12 h光照和12 h黑暗的環(huán)境中，溫度20～26℃，濕度40%～70%，自由攝食和飲水。由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2006-0015。中藥補腎健脾方水煎劑(南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供)，將生藥黨參20 g, 白術(shù)15 g, 熟地20 g, 菟絲子15 g, 淫羊藿10 g, 仙茅10 g, 川斷10 g, 杜仲10 g, 山茱萸15 g加水煎煮2次，合并煎液、過濾、濃縮成每1 mL含生藥1.5 g的中藥混懸液。研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 腎虛型排卵障礙大鼠動物模型的構(gòu)建 造模組大鼠按羥基脲450 mg/kg灌胃，連續(xù)灌胃8 d，造模成功。對模型組大鼠分別給予針刺+中藥(針藥合用組)、中藥+假針(中藥組)、針刺+安慰劑中藥(針刺組)、假針+安慰劑中藥(空白對照組)處理。給藥量按人與大鼠體表面積比換算得出，針刺穴位定位依據(jù)林文注“實驗針灸學”。(1)空白對照組：生理鹽水灌胃1 mL/100 g后，于木板上捆綁四肢20 min，腹部朝上，1次/d，共5 d。(2)針刺組：于木板上捆綁四肢腹部朝上，取穴氣海、關(guān)元、雙側(cè)三陰交。進針0.3 cm，行平補平瀉法，電針20 min，以肢抖動為度，1次/d，連續(xù)5 d。(3)中藥組：補腎健脾方水煎劑混懸液，灌胃按1 mL/100 g后，于木板上捆綁四肢20 min，腹部朝上，1次/d，共5 d。(4)針藥合用組：于木板上捆綁四肢腹部朝上，補腎健脾方水煎劑混懸液灌胃(劑量同上)合用針刺(取穴及針法同上)，1次/d，共5 d。

1.2.2 RT-qPCR技術(shù) 取各組大鼠新鮮的卵巢組織，于研缽粉碎，加入Triol并按RNA提取試劑盒的指示提取Total RNA，然后按照試劑盒進行基因組DNA去除、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR等實驗步驟。以空白對照組作為對照組，以β-actin作為內(nèi)參照，分別檢測其余三組大鼠卵巢新鮮組織中的TGF-β1、smad3以及smad7的mRNA表達情況。RT-qPCR特異性引物(TGF-β1正向：5′-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3′、反向：5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3′； smad3正向：5′-GGC-AGGATGTTTCCAGCTA-3′、反向：5′-GCAGTCCACAGA CCATGTCA-3′；smad7正向：5′-GACAGCTCAATTCGGACAACA-3′、反向：5′-CAGTGTGGCGGACTTGATGA-3′；β-actin正向：5′-AGGGAAAT-CGTGCGTGACAT-3′、反向：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′)。

1.2.3 Western blot技術(shù) 取各組大鼠新鮮的卵巢組織，于研缽粉碎，加入RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑進行細胞裂解，并按Western blot操作流程進行變性、定量調(diào)平、電泳、電轉(zhuǎn)、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、曝光等步驟。分別檢測各組大鼠卵巢組織中的TGF-β1、smad3以及smad7的蛋白質(zhì)表達情況。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠新鮮卵巢組織中TGF-β1通路因子的mRNA表達情況 取各組大鼠新鮮的卵巢組織行RT-qPCR實驗檢測TGF-β1通路(包括TGF-β1，smad3和smad7)因子的mRNA表達情況，結(jié)果顯示：針刺組、中藥組及針藥合用組的TGF-β1及smad3的表達均較空白對照組明顯降低，而smad7的表達均較空白對照組明顯升高；且針藥合用組TGF-β1及smad3的表達水平較其他三組最低，而smad7表達較其他三組最高。見表1。

表1 各組大鼠卵巢組織中TGF-β1通路因子的mRNA表達情況

2.2 4組大鼠新鮮卵巢組織中TGF-β1通路因子的蛋白表達情況 取各組大鼠新鮮的卵巢組織行Western blot實驗檢測TGF-β1通路(包括TGF-β1，smad3和smad7)因子的蛋白表達情況，結(jié)果顯示：針刺組、中藥組及針藥合用組的TGF-β1及smad3的表達均較空白對照組明顯降低(P<0.01,P<0.001)，而smad7的表達均較空白對照組明顯升高；且針藥合用組TGF-β1及smad3的表達水平較其他三組最低，而smad7表達較其他三組最高(圖1)。

注：與空白對照組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

本研究中藥自擬補腎健脾方，組方為黨參，白術(shù)，熟地，菟絲子，淫羊藿，仙茅，川斷，杜仲，山茱萸，黃精。針刺取穴：氣海、關(guān)元、兩側(cè)三陰交，行平補平瀉法[10]。關(guān)元為足三陰與沖任之會，又為經(jīng)血之室。任脈起于胞宮，主一身之陰，故關(guān)元可補腎健脾，調(diào)補沖任；氣海位于任脈，是治腎虛要穴，具有補脾統(tǒng)血之功。上述諸穴合用共奏補腎健脾，益氣固攝之功。前期研究中，我們課題組的研究[11]發(fā)現(xiàn)針藥合用能提高大鼠出現(xiàn)動情周期的比例，且能明顯提高未成年大鼠血清FSH、LH及P的水平，表明針藥合用可以促進卵泡發(fā)育及排卵，使增殖期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期，從而可以治療青春期功血。

本研究中我們采用針藥合用處理腎虛型排卵障礙大鼠，然后對各組大鼠的卵巢新鮮組織進行RT-qPCR擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針藥合用組TGF-β1相關(guān)通路包括TGF-β1、TGF-β1受體及smad3 mRNA表達較其他組別均明顯降低，而smad7 mRNA表達較其他組別明顯升高。進一步的Western blot檢測結(jié)果顯示：針藥合用組TGF-β1相關(guān)通路包括TGF-β1以及smad3蛋白表達較其他組別均明顯降低，而smad7蛋白表達較其他組別明顯升高。該結(jié)果初步提示針藥合用可能通過下調(diào)TGF-β1信號相關(guān)通路進而促進腎虛型排卵障礙大鼠卵巢顆粒細胞形態(tài)學的恢復。而TGF-β1是一種多效能的細胞因子，具有廣泛的生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)其參與卵巢顆粒細胞增殖和卵母細胞成熟等生理過程，并可調(diào)節(jié)數(shù)種關(guān)鍵的顆粒細胞酶，對保持理想的卵巢內(nèi)環(huán)境發(fā)揮著重要的作用[7]。卵巢局部的TGF-β1水平異?？蓪е侣雅莅l(fā)育異常和排卵障礙。非活性的TGF-β1被各種酶及活性因子激活時，引起 TGF-β1大量生成和激活，迅速通過與細胞膜上的TGF-β1受體相結(jié)合從而激活細胞內(nèi)的TGF-β1下游smads信號轉(zhuǎn)導通路[12]，進而使smad2/3磷酸化，繼而與smad4相結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復合物，隨即將信號轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)特定基因的表達，發(fā)揮其相應的生物學效應[13-14]。與smad3/4作用相反的是smad7，其在 TGF-β1信號傳導中構(gòu)成負調(diào)節(jié)反饋通路。該蛋白激活后可阻斷其信號通路的轉(zhuǎn)導[12]。因此，本研究證實了針藥合用可能通過抑制TGF-β1信號通路從而促進腎虛型排卵障礙大鼠卵巢顆粒細胞形態(tài)學的恢復。

綜上所述，針藥合用可能通過抑制TGF-β1信號通路，進而抑制smad3、促進smad7的表達，從而促進腎虛型排卵障礙大鼠卵巢顆粒細胞形態(tài)學的恢復，進而促進其卵巢功能的恢復。該研究將為臨床改善腎虛型排卵障礙患者的卵巢功能提供一定的實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)，為下一步臨床前研究提供一定的理論價值。

利益相關(guān)聲明：文章所有作者無利益沖突。

作者貢獻說明：劉龍陽負責實驗及論文撰寫，張麗華負責實驗模型建立，莊晨玉負責動物處理，于彩崎負責論文修改，紀娜負責數(shù)據(jù)整理，羅立梅負責文獻查找，曾朝陽負責課題監(jiān)督及論文修改。