楊蒙雅， 張春月， 伊進行， 王怡明， 卓明洋， 馬 倩， 謝希賢

（天津科技大學 生物工程學院，天津 300457）

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），4，5-二羰基-1-吡咯-2，3-f-喹啉-2，7，9-三羧酸，具有抗氧化[1]、維持線粒體功能[2]、介導電子傳遞等作用，在食品、農(nóng)業(yè)[3]、醫(yī)療保健[4]、經(jīng)濟動物養(yǎng)殖[5-6]、傳感器制造[7-8]等行業(yè)應用廣泛，市場前景廣闊。目前，PQQ的生產(chǎn)方法主要為化學合成法、提取法和生物發(fā)酵法。早在1993年，Martin等人[9]就已經(jīng)能夠通過9步反應將PQQ的產(chǎn)量提升至千克。目前PQQ的生產(chǎn)仍主要依靠化學法合成，但是利用化學法合成PQQ存在步驟多、得率低[10]、對環(huán)境污染較大、反應能耗大等問題；提取法主要是從天然產(chǎn)物中提取，但是天然產(chǎn)品中PQQ含量極低，一般在ng/g或ng/mL的范圍內[11]，且成本較高、利潤較低。雖然目前有少量以納豆為原料經(jīng)提取法生產(chǎn)的PQQ，但是相關文獻報道較少；目前生物發(fā)酵法在一些高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)中已經(jīng)有了成功應用。發(fā)酵法合成PQQ能夠減少對環(huán)境的污染，具有生產(chǎn)過程安全、能耗低、利潤大的優(yōu)勢，更加符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。

PQQ生產(chǎn)菌株主要是一些革蘭氏陰性菌。其生物合成過程主要由pqq基因簇編碼的多個蛋白質催化，不同來源的pqq基因簇存在一些差異，如肺炎克雷伯氏菌[12]（Klebsiella pneumoniae）含有一個單獨的pqqABCDEF基因簇，而氧化葡萄糖酸桿菌[13]（Gluconobacter oxydans） 和 醋 酸 鈣 不 動 桿 菌[14]（Acinetobacter calcoaceticus）均 含 有 一 個 單 獨 的pqqABCDE基因簇，但是還有一些菌株的PQQ合成較為復雜，如Methylovorus sp.MP688[15]，除了含有一個單獨的pqqABCDE和pqqFG基因簇外，還含有4個單獨的pqqA基因；Hyphomicrobium denitrificans FJNU-R8[16]含有3個獨立的pqqA基因，一個pqqADE基因簇和一個pqqABCDE基因簇。目前研究的比較多的是氧化葡萄糖酸桿菌，相較其他來源的pqq基因，除pqqA與pqqB之間有一個較短的保守序列外，其余的pqqB、pqqC、pqqD、pqqE之間緊密相連，代謝途徑清晰，便于研究。在G.oxydans中，pqqA的作用在于生成一段含有Glu和Tyr的多肽，PqqD則是作為分子伴侶與PqqA形成一定的空間結構，保障PqqA能夠在PqqE的作用下完成谷氨酸和酪氨酸殘基的連接，PqqC進行PQQ合成最后一步的催化作用，PqqB則與PQQ中間產(chǎn)物在細胞周質空間當中的轉運有關[17]。除pqqABCDE基因簇外，氧化葡糖酸桿菌中的tldD基因也與PQQ生物合成有關，可能與其他PQQ合成細菌中的pqqF基因具有類似的功能[18]。

PQQ天然生產(chǎn)菌株都能夠產(chǎn)生利用PQQ的蛋白質，與這些菌株類似，大腸桿菌本身含有的D-葡萄糖脫氫酶（GDH）也以PQQ為輔酶，在合成全酶之后能夠氧化葡萄糖為葡萄糖酸，由于大腸桿菌自身缺少PQQ合成通路[19]，只能依靠攝取外源PQQ使醌蛋白表達功能[20]，但是在外源引入pqq基因簇后能夠合成PQQ[21]，這使得工程化大腸桿菌高產(chǎn)PQQ成為可能。

如表1所示，目前PQQ高產(chǎn)菌株的選育主要集中在菌種篩選和分子改造兩個方向，其中誘變篩選[22]、定向進化[23]的效果相比基因改造更加明顯，但是定點篩選、定向進化存在周期長、工作量大、遺傳背景不清晰、篩選難度大、后續(xù)改造困難等一系列問題；以模式微生物為底盤進行分子改造具有周期短、遺傳背景清晰、能夠精準改造的優(yōu)點，其中以大腸桿菌為底盤生物進行改造不僅在代謝合成內源性化合物領域具有強大的工業(yè)潛力，其在重構異源合成途徑代謝生產(chǎn)化學品領域也具有極大的應用前景。

表1總結了部分前人的研究結果，目前對于pqq基因簇的過表達實驗研究較少，形式單一，一般是以質粒為表達載體進行單個基因的過表達，雖然改造周期短，效果明顯，但是質粒和基因組上過表達的結果有一定差異。除此之外，雖然此前的研究從不同的角度進行了嘗試，但是在大腸桿菌中異源表達pqq基因簇還沒有系統(tǒng)的研究。作者利用CRISPR/Cas9技 術 將G.oxydans 621H來 源 的pqqABCDE基因簇以及相關的基因在大腸桿菌基因組上進行構建與優(yōu)化，構建的菌株72 h搖瓶發(fā)酵最高產(chǎn)量達到86.3 mg/L，是目前以大腸桿菌為底盤生物進行基因組編輯生產(chǎn)PQQ的最高產(chǎn)量。已報道的以大腸桿菌為底盤生物進行改造的PQQ工程菌最高產(chǎn)量為王朝絢[24]構建的以質粒為載體的PQQ生產(chǎn)菌，產(chǎn)量達到119.8 mg/L。與其相比，本研究的基因組改造表達更穩(wěn)定，能夠為后續(xù)以大腸桿菌為底盤生物改造生產(chǎn)PQQ及相關代謝產(chǎn)物提供思路。

表1 不同微生物中PQQ提升策略及產(chǎn)量Table 1 Strategies and yields of PQQ production improvement in different microorganisms

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本研究所用的菌株與質粒信息見表2，基因克隆與基因組編輯所用的引物信息見表3，利用E.coliDH5α進行常規(guī)的基因克隆工作。以作者所在實驗室 構 建 的E.coli W3110、△lacIZ：：PxylF-T7RNAP、mlc：：mlc*即PQQ-0菌株為出發(fā)菌株；限制性內切酶、STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶：均購自TaKaRa；引物、G.oxydans 621H來源的pqq基因簇及tlDd基因：均由蘇州金唯智科技有限公司合成；PQQ標品：購自大連美侖生物技術有限公司；KOH和NBT（氯化硝基四氮唑藍）：購自aladdin。

表2 菌株信息Table 2 Strains used in this study

表3 本研究所用引物Table 3 Primers used in this study

續(xù)表2

續(xù)表3

續(xù)表3

1.2 大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯

1.2.1 重組DNA片段構建根據(jù)已知的目的基因序列，利用Primer Primier 5進行引物設計，通過PCR獲得目的基因片段。在待敲除或待整合位點分別設計引物，通過PCR擴增500 bp左右的上下游同源臂。進行基因整合時，對上游同源臂、目的基因、下游同源臂進行重疊PCR，獲得一段完整的重組DNA片段。進行基因敲除時，對上游同源臂和下游同源臂進行重疊PCR。

1.2.2 pGRB質粒的構建利用CRISPR RGEN Tools（http：//www.rgenome.net/cas-designer/）選 擇 待整合/敲除位點附近的PAM序列（5′-NGG-3′），并通過合成線性化引物將相應的20 bp的gRNA序列引入單鏈DNA中，之后通過PCR退火形成雙鏈片段。將雙鏈片段與線性化pGRB載體按照同源重組連接反應 體系 （4 μL 5×CEⅡBuffer，50~200 ng pGRB載體，50~200 ng雙鏈目的片段，2 μL Exnase?Ⅱ重組酶，20 μL ddH2O），化學法轉化至E.coli DH5α感受態(tài)中，篩選陽性克隆并提取質粒。

1.2.3 基因整合與敲除過程根據(jù)文獻[34]報道的CRISPR/Cas9基因編輯技術進行E.coli基因組DNA的整合和敲除。操作體系由目標重組DNA片段、提供gRNA片段的pGRB質粒和提供Cas9蛋白及RED重組酶的pREDCas9質粒構成。具體方法為：先將pREDCas9質粒轉化至待改造的E.coli感受態(tài)細胞中，然后將上述重組pGRB質粒和重組DNA片段電轉至含有pREDCas9質粒的感受態(tài)細胞中，電轉后加入SOC復蘇液于32℃培養(yǎng)2 h，取100 μL菌液涂布于AmpR和SpeR抗性的培養(yǎng)皿，32℃培養(yǎng)，篩選陽性克隆。將篩選到的陽性菌株在含0.2 g/dL阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導pREDCas9中的pGRB消除系統(tǒng)，對pGRB質粒進行消除，篩選在奇霉素抗性平板生長但在氨芐霉素抗性平板不生長的陽性克隆，即為丟失了pGRB質粒的克隆。利用pREDCas9的溫敏特性，可以在42℃培養(yǎng)過夜消除，篩選在無抗平板生長而在SpeR平板不生長的單克隆菌株，即為相應改造的無質粒工程菌株[34]。

1.3 搖瓶發(fā)酵

首先在5 mL LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L）中進行菌種活化，其次在固體斜面培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，牛肉膏10 g/L，蔗糖1 g/L，瓊脂粉20 g/L）進行菌種二代活化，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后轉移至新的固體斜面進一步培養(yǎng)12 h。用接種環(huán)刮取菌體，接種于500 mL三角瓶中（含有30 mL培養(yǎng)基），用九層紗布封口，在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)10~12 h至OD600為8.0左右。種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，體積分數(shù)2%苯酚紅溶液，消泡劑1滴，pH 7.0~7.2。

將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照10%的接種體積分數(shù)接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至發(fā)酵結束。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.12 g/L，KH2PO43 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1 g/L，CaCl26H2O 0.219 g/L，MgSO4·7H2O 0.492 g/L，木糖10 g/L，2%苯酚紅溶液，pH 7.0，消泡劑1滴。在發(fā)酵過程中，根據(jù)苯酚紅指示劑的顏色變化，及時以氨水調整pH至7.0左右，以60 g/dL的葡萄糖溶液補充碳源。

1.4 PQQ檢測方法

1.4.1 幾種檢測方法的比較目前檢測PQQ的方法有高效液相色譜法、液質聯(lián)用法、酶法檢測、質譜檢測、非酶法檢測等。PQQ極易溶于水，且攜帶3個羧基，顯酸性，液相檢測法在15.625~500 mg/L范圍內線性關系良好，但是檢測時易拖尾且峰寬，導致檢測結果不準確[39-40]。比高效液相色譜法更精確的檢測方法如液質聯(lián)用[41]等檢測限也都遠高于實際產(chǎn)量，且檢測前需要對發(fā)酵液進行預處理，由于在預處理過程中可能導致一部分PQQ損失，造成結果不準確。酶法檢測比較靈敏，能夠檢測到20×10-12g的PQQ[42]，但是由于PQQ易與親核的氨基酸和蛋白質反應[43]，因此目前在大腸桿菌中構建PQQ代謝通路選擇的培養(yǎng)基均為細菌基本培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中僅有的碳源為葡萄糖，而發(fā)酵液中含有Mg2+、Ca2+，酶法檢測的原理是預先混合PQQ和純化后的D-GDH（或粗酶液）反應一段時間后形成有活性的DGDH，隨后加入反應液[44]（含DCIP、PMS、葡萄糖、MgSO4的混合溶液），形成了氧化還原反應完整的反應鏈，通過計算DCIP的褪色速率與標準品比較可以計算得到發(fā)酵液中PQQ的濃度。但是發(fā)酵液中濃度不等的殘留葡萄糖會對檢測結果產(chǎn)生較大的影響，尤其對于補料分批培養(yǎng)。非酶法檢測PQQ[45]應用廣泛，主要利用PQQ在堿性條件下氧化甘氨酸，將電子傳遞給NBT，使得NBT生成藍紫色的甲臜類化合物，該物質在OD530有最大吸光度，非酶法檢測不僅能夠同時處理多個樣品，檢測限可以低至3.906 ng/mL，而且發(fā)酵液中的殘?zhí)菍ζ錈o影響[24，28，32-51]?；谝陨媳容^，本實驗選擇的檢測方法為非酶法。

1.4.2 PQQ的非酶法檢測將待測樣品于13 000 r/min離心3 min，取上清液。依次在96孔板中加入180 μL Gly-KOH溶液（2 mol/L Glycine，用KOH將pH調至10），80 μL PB溶液（NaH2PO4·2H2O 1.911 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.776 g/L），20 μL樣品，20 μL NBT母液（NBT固體2.943 g/L，用20 mmoL PB溶液溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻后于30℃避光孵育1 h，用酶標儀檢測OD530條件下的吸光度。

1.5 菌體量的計算

使用分光光度計測量菌液稀釋后的OD600，并且對烘干后的菌體進行稱重，得到細胞干質量與OD600之間的對應關系。

DCW（g/L）=0.382×OD600×稀釋倍數(shù)。

2 結果與討論

2.1 過表達pqqA和pqqB對PQQ產(chǎn)量及生物量的影響

在PQQ的合成中，PqqA作為其前體物質，在分子伴侶PqqD的保護下經(jīng)過PqqE的作用完成谷氨酸和酪氨酸殘基的連接，PqqB負責中間產(chǎn)物在周質空間當中的轉運，PqqC負責合成最后的催化，TlDd可能起到切割作用。PqqA作為前體物提升其表達量能夠促進PQQ的產(chǎn)生。以作者所在實驗室構建的E.coli W3110，△lacIZ：：PxylF-T7RNAP，mlc：：mlc*即PQQ-0為出發(fā)菌，該菌株基因組上已經(jīng)整合了T7RNA聚合酶，可以通過添加木糖控制T7RNA聚合酶的表達。由于基因距離啟動子的位置不同會導致表達量不同，柯崇榕等[16]以雙質粒系統(tǒng)分別過表達了脫氮生絲微菌來源的pqqA和pqqBCDEF，與單質粒系統(tǒng)相比，產(chǎn)量有所提升。楊雪鵬等[29]比較了G.oxydans 621H來源的pqq基因簇在不同質粒中的表達情況，發(fā)現(xiàn)以PET-28a為表達載體產(chǎn)量最高，能夠達到約2 mg/L，說明PT7啟動子也適合于PQQ的合成。因此，在PQQ-0的基礎上，我們在mbha和ygay這兩個假基因位點以PT7為啟動子整合了pqqA和pqqBCDE基因簇，打通了PQQ合成通路，構建了PQQ-1菌株。

G.oxydans 621H中pqqABCDE共用一個啟動子，Li等[46]的研究表明，pqqA的表達強度遠高于其余幾個pqq基因，這也符合PqqA作為PQQ合成前體物的特征。李盼盼[47]的研究也表明，外源添加PqqA就能夠提升PQQ產(chǎn)量。PQQ的結構中有谷氨酸和酪氨酸，雖然谷氨酸和酪氨酸不是其直接的前體物，但已有實驗證明了外源添加谷氨酸和酪氨酸能夠提升PQQ的產(chǎn)量[31-32]。增強pqqA的表達可以為PQQ的合成提供直接前體物，因此，本研究在菌株PQQ-1中利用PT7啟動子強化了pqqA的表達，得到了PQQ-2菌株，搖瓶發(fā)酵72 h的結果見圖1。PQQ-1產(chǎn) 量 為62.6 mg/L，強 化 了PqqA合 成 的PQQ-2菌 株 產(chǎn) 量 為67.8 mg/L，較PQQ-1提 升8.3%，且生物量提升4.3%?？梢?，強化pqqA的表達對PQQ的合成與菌體生長均有促進作用。

圖1 過表達pqqA和pqqB對PQQ合成及菌體量的影響Fig.1 Effects of over-expression of pqqA and pqqB on PQQ synthesis and biomass

在PQQ-2的基礎上，進一步強化pqqB的表達，分別以Ptrc和PT7為啟動子，在PQQ-2中同一假基因位點過表達了pqqB，構建了菌株PQQ-3和PQQ-4。PQQ-3菌株與PQQ-4菌株72 h PQQ產(chǎn)量較PQQ-2均上升，產(chǎn)量分別為68.8 mg/L和82.3 mg/L。從生物量的角度考慮，PQQ-3的生物量較PQQ-2下降了3.6%，下降的幅度較小，而PQQ-4的生物量較PQQ-2下降了9.3%，也低于PQQ-1的菌體量。PQQ-4在搖管活化培養(yǎng)中也出現(xiàn)了菌體早衰的現(xiàn)象，結合后續(xù)改造的需要考慮，我們選擇了PQQ-3作為下一步改造的出發(fā)菌。PQQ-3和PQQ-4的產(chǎn)量和菌體量的差異可能是由于PT7的啟動強度較Ptrc更強，PQQ-4在表達更多PqqB蛋白的同時對菌體的生長影響更大。Wang等[48]在G.oxydans WSH003中以pqqA的啟動子和tufB啟動子分別過表達pqq單個基因時也印證了強啟動子能夠更大程度促進PQQ的生產(chǎn)。

2.2 過表達pqqC、pqqD及pqqE對PQQ產(chǎn) 量及菌體量的影響

選擇篩選出的PQQ-3作為出發(fā)菌，探索過表達pqqC、pqqD、pqqE對產(chǎn)量提升以及對菌體生長的影響。由于PT7啟動子過強，在PQQ-4的培養(yǎng)和發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)對菌體生長影響較大，因此后續(xù)改造均選擇Ptrc啟動子進行相關基因表達控制。分別在PQQ-3菌株中引入Ptrc控制的pqqC、pqqD、pqqE基因，得到PQQ-5、PQQ-6、PQQ-7菌株；在PQQ-5菌株中引入Ptrc控制的pqqC，構建了PQQ-8；在PQQ-6中引入Ptrc控制的pqqD，得到PQQ-9；在PQQ-7中引入Ptrc控制的pqqE，得到PQQ-10，發(fā)酵結果見圖2。改造后只有PQQ-7產(chǎn)量較PQQ-3有所上升，72 h產(chǎn)量能夠達到74.8 mg/L，較改造前上升了8.7%，其余的菌株PQQ產(chǎn)量在改造后均出現(xiàn)了下降。

圖2 過表達pqqC、pqqD及pqqE對PQQ產(chǎn)量及菌體量的影響Fig.2 Effects of over-expression of pqqC,pqqD and pqqE on PQQ yield and biomass

本研究的結果表明，pqqA、pqqB和pqqE在大腸桿菌基因組上的過表達對PQQ產(chǎn)量的提升有正向作用，且在pqqA的過表達中強啟動子PT7的效果優(yōu)于Ptrc。但是對于pqqC和pqqD的表達后出現(xiàn)了產(chǎn)量下降，推測原因可能是在PQQ的合成過程中，PqqC蛋白行使的是PQQ生成最后一步的催化功能，PqqD蛋白作為pqqA的分子伴侶，其參與的反應可能不是PQQ合成的限速步驟，因此在pqqC和pqqD過表達以后，降低了其他關鍵酶的表達量，導致PQQ-5和PQQ-6較PQQ-3產(chǎn)量下降，因此選擇PQQ-7作為下一步改造的出發(fā)菌株。

2.3 過表達不同來源的tlDd基因對PQQ產(chǎn)量及生物量的影響

G.oxydans 621H中對PQQ合成有影響的除了pqqABCDE以外，還有距離該基因簇較遠的tlDd基因，該基因編碼TlDd蛋白，TlDd蛋白可能執(zhí)行PqqF的剪切功能[18]。對G.oxydans 621H中tlDd進行密碼子優(yōu)化后，序列比對顯示，G.oxydans 621H與E.coli K-12 W3110中的tlDd基因同源性高達56%。大腸桿菌自身含有的tlDd可能在PQQ合成中發(fā)揮作用，這也是只在E.coli中過表達pqqABCDE基因簇就能合成PQQ的原因之一。為了比較兩個來源的tlDd基因過表達對PQQ產(chǎn)量的影響，我們在PQQ-7菌株的基礎上構建了4個菌株，均選擇對生長影響較小的Ptrc啟動子進行過表達。

為了探究不同來源的tlDd基因對PQQ產(chǎn)量提升的影響，在PQQ-7菌株上以Ptrc啟動子過表達E.coli來源的tlDd基因，分別得到了tlDd雙拷貝菌株PQQ-11和三拷貝菌株PQQ-13。在PQQ-7菌株上以Ptrc啟動子過表達G.oxydans 621H來源的tlDd基因，分別得到了tlDd雙拷貝菌株PQQ-12和三拷貝菌株PQQ-14。發(fā)酵72 h后產(chǎn)量和菌體量見圖3。在不同批次的發(fā)酵中，由于搖瓶發(fā)酵過程中補氨和補糖的差異，導致PQQ-7產(chǎn)量和菌體量的差異。PQQ-11、PQQ-12、PQQ-13、PQQ-14這4株菌較PQQ-7產(chǎn)量均有所上升，說明本研究選擇的E.coli和G.oxydans兩種不同來源的tlDd基因對于PQQ的產(chǎn)量提升都有促進作用，而PQQ-11較PQQ-12的產(chǎn)量更高，原因可能為大腸桿菌對自身來源的基因適配性更好。對于同一來源的tlDd基因過表達，PQQ-11較PQQ-7產(chǎn)量和菌體量分別提高25.1%和5.2%；PQQ-12較PQQ-7產(chǎn)量提高9.8%，菌體量幾乎一樣，但是兩個參數(shù)的提升量均低于PQQ-11，說明在PQQ-11中進一步強化表達tlDd基因會對菌體量和產(chǎn)量均產(chǎn)生不利影響。綜合PQQ產(chǎn)量和生物量兩個參數(shù)的結果，選擇PQQ-11作為下一步改造的出發(fā)菌株。

圖3 過表達不同來源的tlDd基因對PQQ產(chǎn)量及生物量的影響Fig.3 Effects of over-expression of tlDd from different source on PQQ yield and biomass

2.4 敲除iscR、過表達gcd和ompA對PQQ產(chǎn)量及菌體量的影響

大腸桿菌中存在鐵-硫簇抑制[49]，柯崇榕的研究表明，在培養(yǎng)基中加入Fe2+或敲除大腸桿菌中Fe-S簇的轉錄抑制子iscR均能提高PqqE的表達量，但是通過添加Fe2+的方法需要實驗確定添加量，過量反而會抑制PQQ的生產(chǎn)[16]，因此嘗試通過敲除iscR解除鐵-硫簇抑制。在PQQ-11菌株中敲除iscR基因，獲得PQQ-15菌株，PQQ產(chǎn)量由52.4 mg/L提升為69.2 mg/L，提升了32.1%，菌體量由5.6 g/L提升為6.4 g/L，提升了14.3%，見圖4。iscR的敲除在本研究中對PQQ提升的作用最大，表明E.coli中可能還存在一些內源基因對PQQ的合成有抑制作用。

圖4 敲除iscR、過表達gcd和ompA對PQQ產(chǎn)量及生物量的影響Fig.4 Effects of knockout of iscR,and over-expression of gcd and ompA on PQQ yield and biomass

目前報道的PQQ的高產(chǎn)菌株仍然以甲基營養(yǎng)菌居多，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，這類菌株的細胞膜上有多種能夠利用PQQ的蛋白質[50]。由于GDH的合成并不依賴于PQQ，但是PQQ的合成卻在GDH合成之后才開始[43]。韓增葉[51]的研究表明，在大腸桿菌中引入外源PQQ合成途徑后，在高濃度葡萄糖的刺激下，GDH的表達量有明顯提升。由于GDH本身是脫輔基蛋白質，只有在和PQQ以及Mg2+或Ca2+形成全酶后才有活性。隨著PQQ產(chǎn)量的增加，勢必要提升離子的濃度來適配高產(chǎn)量的PQQ，因此優(yōu)化Mg2+添加量[51]后能夠通過提升GDH的表達量間接促進PQQ的生產(chǎn)。在PQQ-15菌株的基礎上，以Ptrc啟動子過表達E.coli K-12 W3110自身來源的gcd基因，得到了菌株PQQ-16，與PQQ-15相比，PQQ-16產(chǎn)量由69.2 mg/L提升至86.2 mg/L，提升了24.6%，菌體量也由改造前的6.4 g/L提升至6.6 g/L。

ompA是大腸桿菌孔蛋白基因，文獻[24]在肺炎克雷伯氏菌中過表達ompA，發(fā)現(xiàn)促進了胞內PQQ向胞外轉運[24]。因此在PQQ-16的菌株基礎上以Ptrc強啟動子過表達了ompA孔蛋白基因，試圖將胞內產(chǎn)生的PQQ及時轉運出胞外，避免其在胞內的消耗，解除可能存在的反饋抑制。結果表明，與PQQ-16相比，PQQ-17產(chǎn)量略有上升，為86.3 mg/L，菌體量有一定上升，為7.0 g/L。結果表明，以強啟動子Ptrc過表達E.coli自身來源的ompA孔蛋白基因能夠有限提升胞外PQQ濃度，但是產(chǎn)量提升幅度非常小，說明在PQQ-16菌株中，PQQ從胞內向胞外的轉運并沒有受到孔蛋白OmpA表達量的限制。

作者系統(tǒng)研究了異源表達G.oxydans 621H操縱子pqqABCDE以及優(yōu)化底盤相關基因對PQQ合成的影響，獲得了一株能夠高效合成PQQ的工程菌，搖瓶發(fā)酵72 h產(chǎn)量達到86.3 mg/L。

3 結語

作者成功構建了PQQ生產(chǎn)工程菌，為了進一步提升PQQ的產(chǎn)量，后續(xù)改造思路為對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化[24，47-52]，如培養(yǎng)基中的酪氨酸和谷氨酸添加量、金屬離子添加量、發(fā)酵過程中的溶氧等；阻斷部分非必要的碳源代謝降低副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生[31]。