陳 譽， 羅 磊， 王 碩， 李 森， 管 驍

（上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

細(xì)胞的代謝過程中會產(chǎn)生大量自由基，而自由基的積累可導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷，造成氧化應(yīng)激[1]。氧化應(yīng)激的水平的升高可導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生，從而導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的大多數(shù)慢性疾病的發(fā)生[2]。膳食中的抗氧化劑能提供電子，中和自由基，有助于減少自由基造成的損害，維持機體平衡。因此，具有抗氧化活性的膳食功能因子的開發(fā)對于維持人體健康具有重要意義。

多酚是膳食中常見的抗氧化功能因子，具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護等多種功能[3]。多酚來源廣泛，在不同食品中含量及種類差異較大，且多酚的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)?？Х仁鞘澜缦M量第一的飲料，多酚含量豐富，但目前對咖啡多酚的研究多集中于咖啡豆來源的多酚。而咖啡果殼中也含有大量的多酚類化合物，研究發(fā)現(xiàn)咖啡果殼中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%~8.6%[4]，多酚提取物中以咖啡因、綠原酸、阿魏酸、原花青素、羥基苯甲酸及其衍生物居多[5]，但目前對咖啡果殼多酚的提取純化效果有待進一步提高。朱晨薇等[6]也指出咖啡殼中存在酚類物質(zhì)，但不易提取，且多酚類成分由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，目前在提取分離上還存在一定的困難。除此之外，咖啡果殼也是咖啡生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1 t咖啡豆產(chǎn)生等量的咖啡果殼。目前對咖啡果殼的綜合利用主要包括生物燃料[7]和肥料生產(chǎn)[8]，以及酶[9]、膳食纖維[10]和生物活性化合物的提取[11]等。對咖啡果殼多酚活性的深入研究將為咖啡副產(chǎn)物的高值化開發(fā)提供理論依據(jù)。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可激活細(xì)胞膜上表達(dá)的toll樣受體-4（TLR-4）介導(dǎo)的炎癥信號通路觸發(fā)炎癥，是常用的炎癥誘導(dǎo)劑[12]。作者對咖啡果殼中的多酚進行提取純化，分析其抗氧化活性，并通過LPS建立腸細(xì)胞炎癥模型，以探究咖啡果殼多酚的抗炎作用，為深入開發(fā)咖啡副產(chǎn)物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咖啡果殼：普洱市思茅區(qū)來旺咖啡種植場；無水乙醇、沒食子酸、Folin-Ciocateu試劑、無水碳酸鈉、過氧化氫、抗壞血酸、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、三氯甲烷、異丁醇等：上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；LX-17大孔樹脂、2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）：上海維塔有限公司；脂多糖（LPS）：Sigma公司，貨號L2880。DMEM培養(yǎng)基、胰酶：上海生工生物工程股份有限公司；青霉素-鏈霉素原液（100×）、CCK-8試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能磨粉機：上海菲力博寶業(yè)公司；MYP11-2磁力攪拌器：上海梅潁浦儀器儀表制造有限公司；TGL-25M高速冷凍離心機：美國ALPHA公司；KQ-700E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ-18N多歧管壓蓋型真空冷凍干燥機：新芝凍干設(shè)備股份有限公司；Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀：美國Berten公司；CO2培養(yǎng)箱：PHCbi公司；KUBOTA 5500型號冷凍離心機：日本久保田公司；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 咖啡果殼多酚提取物制備及純化將干制的咖啡果殼用高速多功能磨粉機研磨，過80目篩。稱取20.00 g粉于1 L燒杯中，加1 L水，放入轉(zhuǎn)子，保鮮膜封口。磁力攪拌0.5 h，80℃下浸提2 h，8 000 r/min下離心15 min，棄上清液。將沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，磁力攪拌0.5 h，80℃浸提2 h，超聲40 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液。將上清液于50℃下濃縮，濃縮液置于-80℃冰箱預(yù)凍2 h，再凍干，得到粗多酚。

取粗多酚溶于水中，再將液體倒入活化好的LX-17大孔樹脂（活化的大孔樹脂：體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液中浸潤過夜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的HCl沖洗樹脂2 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaOH沖洗樹脂2 h）中進行靜態(tài)吸附2 h，棄濾液，清水沖洗2遍樹脂，再用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液解吸2 h。將解吸液旋蒸、凍干，得到純多酚。

1.3.2 總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用Folin-Ciocalteau法測總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。將沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，用純水配制成0、20、40、60、80、100 μg/mL，分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液于試管中，依次加入1.5 mL福林酚試劑，1 mL 0.2 g/mL的Na2CO3溶液，蒸餾水定容至10 mL，渦旋混勻，室溫下避光靜置1 h，用酶標(biāo)儀在765 nm處測定吸光值。做3次獨立重復(fù)試驗，以沒食子酸當(dāng)量（GAE）表示總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 粗多酚的體外抗氧化活性測定

1）DPPH自由基清除能力測定 參考顏征等[13]的方法。取2 mL樣品溶液和2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）放入試管中，充分反應(yīng)后置于陰涼避光處放置30 min，在517 nm處測定其吸光值。同樣方法以空白溶劑作為對照，用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照測定517 nm的吸光值。

式中：A1為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液的混合溶液的吸光值；A2為2 mL樣品溶液與2 mL空白溶劑的混合溶液的吸光值；A0為2 mL空白溶劑與2 mL DPPH溶液的混合溶液的吸光值。

2）ABTS陽離子自由基清除能力測定 參考王萍等[14]的方法。稱取96.00 mg ABTS于25 mL容量瓶中，加純水溶解并定容；稱取6.63 mg過硫酸鉀于10 mL容量瓶中，加純水溶解并定容。將配置好的ABTS溶液和過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下避光保存12~16 h。用無水乙醇將混合液ABTS+稀釋，使工作液在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。取0.2 mL不同質(zhì)量濃度提取物與3.8 mL ABTS+工作液，混合均勻后室溫下避光反應(yīng)6 min，于734 nm波長下測定吸光值。同理，以空白溶劑為參照、VC為陽性對照，測定734 nm處的吸光值。

式中：Ai為0.2 mL樣品溶液與3.8 mL ABTS與工作液的混合溶液的吸光值；Aj為0.2 mL樣品溶液與3.8 mL空白溶劑的混合溶液的吸光值；A0為0.2 mL空白溶劑與3.8 mL ABTS與工作液的混合溶液的吸光值。

3）羥基自由基清除能力測定 參考楊冰鑫等[15]的方法。取不同濃度的粗多酚樣品溶液1 mL分別加入試管中，分別依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，1 mL 8.8 mmol/L H2O2。充分混勻后靜置1 h，在510 nm處測定吸光值。同樣方法，用蒸餾水作為空白、VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對照在510 nm下測定吸光值。

式中：A1為1 mL樣品溶液、1 mL FeSO4溶液、1 mL水楊酸溶液和1 mL H2O2溶液的混合溶液的吸光值；A2為1 mL空白溶劑、1 mL FeSO4溶液、1 mL水楊酸溶液和1 mL H2O2溶液的混合溶液的吸光值；A0為1 mL樣品溶液、1 mL FeSO4溶液、1 mL水楊酸溶液和1 mL蒸餾水的混合溶液的吸光值。

1.3.4 純多酚的組分分析使用Waters e2695高效液相色譜儀，C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流量0.8 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25℃。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.5 純多酚對LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型的抗炎作用

1）細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2細(xì)胞接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)88%的DMEM、10%的胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%雙抗（100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素）的完全培養(yǎng)基中，置于瓶底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2及相對濕度95%的培養(yǎng)箱中單層生長，實驗時取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

2）LPS誘導(dǎo)的炎癥模型的建立 稱取10 mg LPS，用生理鹽水定容至100 mL，終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，再用培養(yǎng)基將其稀釋成0、2.5、5、10、20、40 μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。于96孔板中每孔加100 μL，種下每孔105個細(xì)胞，每組6個復(fù)孔。待其貼壁后，分別加入不同濃度的LPS。培養(yǎng)24 h后，每孔再加入10 μL的CCK-8溶液孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下測吸光值。通過檢測細(xì)胞活性，確定多酚對于LPS引起的炎癥模型作用的誘導(dǎo)時間。

3）多酚處理細(xì)胞 取0.1 g多酚凍干粉，蒸餾水定容至100 mL，配成1 000 μg/mL的母液，再用培 養(yǎng) 基 稀 釋 成0、5、10、50、100、200、400 μg/mL的溶液。于96孔板中每孔加100 μL，種下每孔105個細(xì)胞，待其貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的多酚溶液。培養(yǎng)24 h后，每孔再加入10 μL的CCK-8溶液孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下測吸光值。

于96孔板中每孔種下5 000個細(xì)胞，每孔100 μL，待其貼壁，長滿至80%左右開始加樣。對照組：培養(yǎng)基孵育24 h；LPS組：20 μg/mL的LPS溶液孵育24 h；LPS+多酚組：不同質(zhì)量濃度的多酚溶液（0、5、10、50、100、200、400 μg/mL）孵育12 h，再換20 μg/mL的LPS溶液孵育24 h。

孵育結(jié)束后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下測吸光值。

4）QPCR法 測 定 細(xì) 胞 中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá) 通過MagzolTM Reagent試劑提取總RNA。使用Hiscript II Q RT Supermix將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用ChamQ Universal SYBY qPCR Master Mix將cDNA擴增，在Thermo Lifetech ABI QuantStudio3儀器上進行實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）分析。為了檢測細(xì)胞中基因的表達(dá)情況，使用β-actin作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt用于計算基因的相對表達(dá)量。引物序列見表2。

表2 qPCR分析引物序列Table 2 Primer sequences used for qPCR analysis

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析用Graph Pad Prism 8.0.2（美國）畫圖，并通過單因素方差分析（one-way ANOVA）對所有數(shù)據(jù)進行顯著性分析。LPS建模的數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0（美國）并用Duncan’s多重比較檢驗進行分析。#表示Con組與LPS組相比，*表示多酚組與LPS組相比（其中，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，#代表P＜0.05，##代表P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡果殼多酚的制備、純化和成分分析

用Folin-Ciocalteau法對總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)沒食子酸質(zhì)量濃度在0~100 μg/mL范圍內(nèi)時，其質(zhì)量濃度與吸光值呈線性關(guān)系。其線性回歸方程為：Y=0.006 240X+0.007 753，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，見圖1。經(jīng)計算，咖啡果殼多酚提取液凍干后的粗多酚總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（92±3.4）mg/g，純化后的咖啡果殼多酚凍干粉中的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（387±5.9）mg/g。

圖1 沒食子酸質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid mass concentration

相對于純化前咖啡果殼多酚提取物，純化后的多酚提取物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，表明LX-17樹脂的純化方法能起到有效分離作用，與鐘嘉倫等的結(jié)果類似[16]。對純化后的多酚進行成分分析，HPLC圖譜見圖2。純化的咖啡果殼多酚主要成分為3，4-二羥基苯甲酸（15.78 μg/mg），綠原酸（37.85 μg/mg）和生物堿咖啡因（55.82 μg/mg），見表3。與NEMZER[17]等的研究結(jié)果一致，他們對市售咖啡果殼進行了多酚提取，發(fā)現(xiàn)多酚提取物中主要含有綠原酸或咖啡因；此外，還含有少量的有機酸（葡萄糖酸、蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸等）、膽堿類衍生物、泛酸、黃嘌呤和蔗糖等活性成分。

圖2 純化后咖啡果殼多酚的HPLC圖（280 nm）Fig.2 HPLC diagram of purified polyph-enols from coffee cherry husks（280 nm）

表3 純化多酚的主要成分Table 3 Main components of purified polyphenols

2.2 咖啡果殼多酚的體外抗氧化活性

DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力是評價多酚抗氧化性的重要指標(biāo)。當(dāng)黃酮類等抗氧化性物質(zhì)與DPPH自由基結(jié)合時會使DPPH溶液的吸光值不斷減小[18]。從圖3（a）中可以看出，DPPH自由基清除的能力隨著多酚質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強，達(dá)到100 μg/mL時，清除率將近100%；而且多酚對DPPH自由基的清除率與VC不相上下，在較低質(zhì)量濃度時甚至優(yōu)于VC。經(jīng)線性擬合，其IC50為3.97 μg/mL。

對ABTS+自由基清除能力檢測結(jié)果見圖3（b）。多酚和VC對ABTS+自由基的清除作用均呈劑量性增加，且低質(zhì)量濃度時多酚的ABTS+自由基清除能力優(yōu)于VC，經(jīng)線性擬合得多酚對ABTS+自由基清除率的IC50為26.09 μg/mL。

對羥基自由基清除能力的檢測結(jié)果見圖3（c）?？Х裙麣ざ喾訉αu自由基的清除能力低于VC，IC50為543.3 μg/mL。以上結(jié)果表明，咖啡果殼多酚對DPPH、ABTS+和羥基自由基均具有良好的清除能力。朱晨薇等[6]也做過咖啡殼酚類物質(zhì)的提取，其DPPH、ABTS+自 由 基 清 除 能 力 的IC50約 為60、80 μg/mL，這也體現(xiàn)出LX-17樹脂純化效果的優(yōu)良。根據(jù)對咖啡果殼多酚成分的分析，咖啡因是主要成分之一，根據(jù)DALAL等[19]的報道，其抗氧化機制是通過清除和修復(fù)羥基自由基來發(fā)揮作用的。活性氧失調(diào)會引發(fā)氧化損傷，而綠原酸可通過阻斷Ca2+通道降低活性氧含量，從而減輕LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷[20]。3，4-二羥基苯甲酸（原兒茶酸），與沒食子酸、咖啡酸等其他抗氧化化合物結(jié)構(gòu)相似，可以通過提供氫原子清除自由基來顯示抗氧化活性[21]。

圖3 咖啡果殼多酚體外抗氧化能力Fig.3 In vitro antioxidant capacity of polyphenols from coffee cherry husks

2.3 咖啡果殼多酚對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型中細(xì)胞增殖活力的影響

為了建立LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型，首先研究了不同質(zhì)量濃度和不同時間下LPS對Caco-2細(xì)胞增殖活力的影響。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的LPS對Caco-2細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，見圖4（a）。當(dāng)LPS質(zhì)量濃度為20 μg/mL時，細(xì)胞存活率高于60%，而40 μg/mL的LPS使細(xì)胞存活率低于40%（不足IC50）。采用單樣本T檢驗，20 μg/mL LPS處理組的細(xì)胞存活率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），因此選用20 μg/mL作為LPS的質(zhì)量濃度。這與楊柳[22]建立的LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞炎癥模型的質(zhì)量濃度一致。對LPS的處理時間進行優(yōu)化，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞12、24、36、48 h后檢測細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)24 h后的細(xì)胞活力已經(jīng)接近IC50，見圖4（b），因此以24 h作為LPS的誘導(dǎo)時間。

根據(jù)以上條件建立LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞模型，檢測不同質(zhì)量濃度咖啡果殼多酚對細(xì)胞增殖能力的影響。首先用不同質(zhì)量濃度的多酚預(yù)處理細(xì)胞12 h，再經(jīng)過20 μg/mL LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞24 h，觀察不同劑量的咖啡果殼多酚對LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見圖4（c）。20 μg/mL的LPS可以抑制Caco-2細(xì)胞增殖，而低劑量酚組（5、10 μg/mL）細(xì)胞的存活率與對照組相比無明顯差異，并顯示出多酚處理對LPS作用的拮抗；隨著多酚處理質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞的存活率逐漸下降，多酚處理質(zhì)量濃度為100 μg/mL及以上時，與LPS組相比不再有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖4 咖啡果殼多酚對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型的影響Fig.4 Effects of polyphenols from coffee cherry husks on the LPS-induced inflammation cell model

2.4 咖啡果殼多酚對LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響

如圖5所示，20 μg/mL的LPS處理能夠顯著刺激Caco-2細(xì)胞中IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄。不同質(zhì)量濃度的咖啡果殼多酚處理細(xì)胞 后，細(xì) 胞 內(nèi)IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均得到顯著抑制。與LPS模型組細(xì)胞相比，咖啡果殼多酚使IL-6和IL-10的轉(zhuǎn)錄水平降低至10.6%和4.2%；高質(zhì)量濃度的咖啡果殼多酚（200和400 μg/mL）能夠分別使IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平降低至32.1%和48.0%，使TNF-α轉(zhuǎn)錄水平降低至22.3%和33.9%。以上結(jié)果表明，咖啡果殼多酚預(yù)處理對于LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞Caco-2的炎癥具有明顯抑制作用。根據(jù)表3的成分分析，咖啡果殼多酚主要含有咖啡因、綠原酸和3，4-二羥基苯甲酸。Karuppagounder[23]發(fā)現(xiàn)咖啡因可通過恢復(fù)內(nèi)源性抗氧化劑平衡來抑制神經(jīng)炎癥，Tan[24]也證實了綠原酸可通過清除自由基的作用減輕小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥。因此推測咖啡果殼多酚可能通過清除自由基來降低炎癥基因的表達(dá)，但發(fā)揮作用的是單一組分還是混合組分需要進一步探討。

圖5 咖啡果殼多酚對LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中炎癥因子的相對表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of polyphenols from coffee cherry husks on the relative expression of inflammatory factors in LPS-induced Caco-2 cells

3 結(jié)語

LX-17大孔樹脂對咖啡果殼多酚提取物具有良好的純化效果，純化后多酚的主要成分為3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸和咖啡因，能有效清除DPPH自由基、ABTS+自由基及羥基自由基，具有良好的抗氧化作用。對LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型的研究顯示，低質(zhì)量濃度的咖啡果殼多酚能夠抑制LPS引起的細(xì)胞活力的下降，但高質(zhì)量濃度多酚無顯著作用；同時，咖啡果殼多酚顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，對Caco-2細(xì)胞起到一定的保護作用。本研究也存在一些不足，例如起抗炎作用的對象主要來源于多酚化合物還是其中單一的組分，發(fā)揮作用的具體分子機制等需要進一步探究。