王永利， 付 剛， 張子夢3，， 林心萍， 張大偉*

（1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；4.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

七烯甲萘醌（menaquinone-7，MK-7）是維生素K2的一種。維生素K2根據(jù)甲萘醌骨架C3側(cè)鏈上異戊二烯基個數(shù)的不同有MK-3到MK-14等多種形式[1]。MK-7是脂溶性物質(zhì)，可溶于異丙醇、甲醇等有機溶劑，見光易分解等。MK-7可預(yù)防或減輕很多病癥，例如常見的心血管疾病、癌癥、炎癥、糖尿病、慢性腎臟疾病、免疫紊亂和阿爾茨海默氏病等[2-3]。此外，維生素K2相關(guān)產(chǎn)品可以有效預(yù)防和緩解由于人口老齡化、久坐不動的生活方式和普遍的維生素D缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松[4]。還有研究表明，維生素K2能充當(dāng)γ-谷氨酰羧化酶的輔助因子，γ-谷氨酰羧化酶可以催化維生素K依賴性蛋白（VKDPs）由谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為γ-羧基谷氨酸[5-6]。

MK-7的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)是目前研究的重點問題之一。由于傳統(tǒng)的化學(xué)合成法生產(chǎn)MK-7效率低下、污染環(huán)境和合成的順式結(jié)構(gòu)的低活性，利用微生物細胞工廠生產(chǎn)MK-7越來越受到關(guān)注。微生物發(fā)酵生產(chǎn)MK-7具有全反式結(jié)構(gòu)活性的優(yōu)勢[7]，近年來研究者相繼在Bacillus subtilis natto[8]、Lactococcus lactis[9]、Escherichia coli[10]菌 株 中 進 行 了MK-7合成的研究工作?，F(xiàn)有對MK-7生物合成研究最多的菌株仍然是枯草芽孢桿菌，如：Ma等人在枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis 168，B.subtilis 168）中設(shè)計過表達了不同組合的基因，增強了甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸途徑（MEP pathway）代謝流，從而提高了MK-7的生物合成量[11]；Yang等人通過將整個代謝途徑分為4個模塊后，分別進行強化從而提高了MK-7發(fā)酵產(chǎn)量[12]；Zhang等人設(shè)計構(gòu)建了群體感應(yīng)系統(tǒng)，實現(xiàn)了目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成與細胞生長之間的動態(tài)平衡，有效提高了MK-7的產(chǎn)量[13]?？莶菅挎邨U菌通常被認為是食品安全級菌株（Generally regarded as safe），代謝工程研究中枯草芽孢桿菌作為模式菌株具有較高的遺傳可操作性和穩(wěn)定性。因此，在我們的研究中也將B.subtilis 168作為出發(fā)菌株。

微生物生產(chǎn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物是一個復(fù)雜的過程，需要許多中間產(chǎn)物的參與與多個反應(yīng)的協(xié)調(diào)[14]。如圖1所示，作者通過基因敲除、基因定點突變等策略驗證了目標(biāo)產(chǎn)物合成的部分瓶頸；同時通過構(gòu)建及過表達人工操縱子，進一步明確了充足的前體供應(yīng)有助于MK-7的積累，為后續(xù)代謝改造高產(chǎn)菌株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

圖1 枯草芽孢桿菌中的MK-7合成途徑Fig.1 MK-7 synthetic pathway in B.subtilis

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物本研究所用菌株和質(zhì)粒列于表1，所用引物列于表2。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要試劑酵母粉：北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；瓊脂：上海吉至生化科技有限公司；正己烷、異丙醇、蛋白胨、MgSO4·7H2O、K2HPO4：上海麥克林生化科技有限公司；NaCl：生工生物工程（上海）股份有限公司；甘油、大豆蛋白胨、麥芽糖：北京索萊寶科技有限公司；異戊烯醇：北京華威銳科化工有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、柱式PCR膠回收試劑盒：OMEGA公司；一步克隆試劑（ClonExpress?Ⅱ/Multis）、2×Taq PCR Master Mix：南京諾維贊生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15~20 g/L瓊脂，121℃滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油30，大豆蛋白胨60，酵母粉5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO43，121℃滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備恒溫搖床：上海知楚儀器有限公司；可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；小型臺式離心機、PCR儀：Eppendorf公司；恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；真空離心濃縮儀-CV200：北京吉艾姆科技有限公司；H-Class/QDa液質(zhì)聯(lián)用儀：沃特世公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因敲除以在B.subtilis 168中敲除基因araM為例。以B.subtilis 168基因組為模板，分別用引物ΔaraM-UP-F/R、ΔdhbB-DN-F/R進行PCR擴增，得到基因araM上下游片段：araM-UP、araMDN；以質(zhì)粒PDG為模板，用引物ΔaraM-CR-F/R進行PCR擴增，得到氯霉素抗性基因片段araM-CR。將3個片段純化后按照araM-UP、araM-CR、araMDN的順序進行多片段融合。利用同源重組整合到B.subtilis 168基因組完成敲除[15]，同時在引物ΔaraMCR-R和ΔaraM-DN-F中各添加100 bp上游同源臂序列進行同源重組完成無痕敲除?；騪tsG和基因dhbB也用上述方法完成敲除。

1.2.2 人工操縱子的構(gòu)建以人工操縱子AO-KF的構(gòu)建為例。以B.subtilis 168基因組為模板，分別用引物AO-KF-aroK-F/R、AO-KF-aroE-F/R、AO-KF-aroF-F/R進行PCR擴增，得到KF-aroK、KFaroE、KF-aroF共3個片段。將片段純化后按照KFaroK、KF-aroE、KF-aroF的順序進行多片段融合[16-17]，每個基因前通過引物添加RBS序列。

續(xù)表1

續(xù)表2

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以pDG-menA質(zhì)粒的構(gòu)建為例。以B.subtilis 168基因組為模板，用引物menA-Frag-F/R進行PCR擴增，得到片段pDGmenA-Frag；以pDG質(zhì)粒為模板，用引物menAVect-F/R進行PCR擴增，得到帶有麥芽糖啟動子PmalA的片段pDG-menA-Vect。將片段純化后利用一步克隆試劑盒完成無縫克隆[18-19]，最后進行大腸桿菌商業(yè)感受態(tài)DH5α轉(zhuǎn)化，利用氨芐西林（Amp）抗性篩選得到pDG-menA質(zhì)粒。質(zhì)粒pDG-AD、pDG-KF、pDG-HF、pDG-menA（menA-Q67D）-KF也用上述方法完成構(gòu)建。

1.2.4 重組菌株的構(gòu)建用Spizizen轉(zhuǎn)化方法[20]進行重組菌株的構(gòu)建。

1.2.5 點突變以pDG-menA（menA-Q67D）點突變質(zhì)粒構(gòu)建為例。以pDG-menA質(zhì)粒為模板，用引物menA-Q67D-F/R進行反向PCR擴增，將質(zhì)粒片段純化后進行大腸桿菌商業(yè)感受態(tài)DH5α轉(zhuǎn)化，利用氨芐西林（Amp）抗性篩選得到pDG-menA-Q67D質(zhì)粒。點突變質(zhì)粒pDG-menA（menA-Q67R）、pDGmenA（menA-N74A）、pDG-menA（menA-N74D）、pDG-menA（menA-N74R）也用上述方法完成構(gòu)建。

1.2.6 生長量測定根據(jù)發(fā)酵時長將菌液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，用分光光度計測定發(fā)酵液在OD600處的吸光值。

1.2.7 菌株發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵種子培養(yǎng)：挑取活化的單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 h，培養(yǎng)條件為37℃、220 r/min。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：種子培養(yǎng)液按照初始OD=0.1加到含有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，40℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。每組菌株發(fā)酵設(shè)置3個平行。

1.2.8 MK-7萃取取5 mL發(fā)酵液于250 mL三角瓶中，加入5 mL濃鹽酸進行破壁。破壁完成后加入5 mL異丙醇于200 r/min振蕩10 min，再加入10 mL正己烷振蕩10 min。吸取上層萃取液5 mL放入15 mL離心管中進行真空濃縮。

1.2.9 MK-7檢測與分析取0.5 mL上機液（V甲醇∶V乙腈∶V二氯甲烷=3∶1∶1）加入濃縮產(chǎn)物中進行復(fù)溶，隨后過孔徑為0.22 μm的有機濾頭，取200 μL置于液相內(nèi)襯管中進行檢測。MK-7采用超高效液相色譜（UPLC）檢測，色譜柱為Waters XBridge@BEH C18（2.5 μm，3.0 mm×100 mm），柱溫40℃，進樣量3 μL，檢測波長為270 nm。流動相為100%純甲醇，流量為0.8 mL/min。使用GraphPad Prism 8軟件對單因素實驗進行顯著性分析，用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示實驗數(shù)據(jù)結(jié)果，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝分支途徑基因敲除對MK-7合成的影響

分支途徑基因敲除是代謝工程中常用的改造策略之一。為了得到一株較好的底盤菌，在枯草芽孢桿菌B.subtilis 168的基礎(chǔ)上分別敲除araM、ptsG、dhbB這3個基因。培養(yǎng)基中添加甘油進行發(fā)酵生產(chǎn)MK-7時，甘油經(jīng)過甘油激酶（GlpK）、甘油-3-磷酸脫氫酶（GlpD）的催化生成磷酸二羥丙酮（DHAP），磷酸二羥丙酮可與甘油醛-3-磷酸相互轉(zhuǎn)化進行MK-7的生產(chǎn)與菌體的生長。甘油-1-磷酸脫氫酶（AraM）可催化磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化成甘油醛-1-磷酸（G1P）進入磷酸甘油酯代謝途徑，屬于MK-7代謝競爭途徑[21]。基因ptsG參與調(diào)控糖類的磷酸化與代謝，同時也會消耗MEP途徑前體：磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。由于PEP是MK-7合成的重要前體物質(zhì)，敲除掉基因ptsG會積累PEP參與到MK-7代謝合成中。基因dhbB可以調(diào)控異分支酸（ICHA）進行鐵載體桿菌凝集素的生物合成，屬于MK-7合成途徑的分支途徑[22]。利用經(jīng)典的同源重組方法分別敲除araM、ptsG、dhbB等3個基因，得到MK7-01、MK7-02、MK7-03菌株。

將MK7-01、MK7-02、MK7-03菌株活化后進行發(fā)酵產(chǎn)量驗證。由圖2可以看出，分別敲除掉這3個基因都可以提高MK-7的產(chǎn)量。與對照菌株B.subtilis 168相比，敲除基因dhbB后MK-7產(chǎn)量提高了49.8 %，達到（10.425±0.629）mg/L，是這3個基因敲除中產(chǎn)量提升效果最好的，說明沉默鐵卟啉桿菌素途徑可以使菌體的代謝更多流向MK-7的合成。另外，敲除掉araM基因和ptsG基因后，MK-7產(chǎn)量分別提高了19.4%和46.7%。值得注意的是，MK7-02菌株的MK-7產(chǎn)量與MK7-03菌株相差不多，生物量上具有明顯的優(yōu)勢。

圖2 敲除基因araM、ptsG、dhbB對MK-7產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of araM，ptsG and dhbB gene knock on MK-7 production

2.2 關(guān)鍵基因menA及menA突變體的過表達對MK-7合成的影響

1，4-二羥基-2-萘甲酸-戊烯基轉(zhuǎn)移酶（MenA）是決定MK-7合成途徑效率的關(guān)鍵酶，可催化1，4-二羥基-2-萘甲酸和異戊二烯側(cè)鏈生產(chǎn)DMK，進而生成MK-7。構(gòu)建好過表達重組質(zhì)粒pDG-menA后，參考之前在納豆芽孢桿菌的研究報道[23]，在重組質(zhì)粒pDG-menA的基礎(chǔ)上分別設(shè)計進行menA基因單點突變。其中單點突變位點包括Q67D、Q67R、N74A、N74D、N74R。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pDGmenA及單點突變質(zhì)粒pDG-menA（menA-Q67D）、pDG-menA（menA-Q67R）、pDG-menA（menAN74A）、pDG-menA（menA-N74D）、pDG-menA（menA-N74R）采用Spizizen轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌B.subtilis 168中，成功得到菌株MK7-04（pDG-menA）、MK7-05（Q67D）、MK7-06（Q67R）、MK7-07（N74A）、MK7-08（N74D）、MK7-09（N74R）。

將上述菌株活化后進行發(fā)酵產(chǎn)量驗證。由圖3可以看出，過表達關(guān)鍵基因menA可以明顯提高MK-7的發(fā)酵產(chǎn)量，相比于對照菌株B.subtilis 168提高了3.26倍，MK-7產(chǎn)量達到了（24.84±0.35）mg/L。與過表達menA菌株MK7-04相比，過表達menA突 變 菌 株 中MK7-06（Q67R）、MK7-07（N74A）、MK7-09（N74R）的產(chǎn)量都出現(xiàn)不同程度的降低，MK7-05（Q67D）菌株和MK7-08（N74D）菌株的發(fā)酵MK-7產(chǎn)量分別提高了10.7%和9.6%，達到了（27.50±5.89）、（27.23±0.27）mg/L。說 明 過 表 達menA可以提高MK-7發(fā)酵產(chǎn)量，同時通過篩選途徑關(guān)鍵基因突變體的方式也會進一步提升發(fā)酵產(chǎn)量。

圖3 關(guān)鍵基因menA過表達及點突變菌株的MK-7產(chǎn)量Fig.3 MK-7 production of key gene menA overexpressed strain and menA mutant strains

2.3 人工操縱子過表達對MK-7合成的影響

人工操縱子AO-AD包含4個基因：aroA、aroB、aroC、aroD，將這4個基因組成人工操縱子并利用Gibson assembly的方法連接到麥芽糖誘導(dǎo)型質(zhì)粒pDG上進行過表達。人工操縱子AD可以將磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤蘚糖-4-磷酸（E4P）催化生成莽草酸（SHA）。人工操縱子AO-KF包含3個基因：aroK、aroE、aroF，可催化莽草酸（SHA）生成分支酸（CHA）進入MK代謝途徑。人工操縱子AOHF包含3個基因：hepS、ispA、fni，可催化五碳的異戊烯基二磷酸（IPP）疊加合成三十五碳的庚丙烯基二磷酸（HDP），進一步與1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA）縮合形成MK-7。將上述人工操縱子過表達質(zhì)粒pDG-AD、pDG-KF、pDG-HF采用Spizizen轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌B.subtilis 168中，分別得到MK7-10菌株、MK7-11菌株、MK7-12菌株。

將MK7-10菌株、MK7-11菌株、MK7-12菌株活化后發(fā)酵驗證產(chǎn)量。由圖4可以看出，過表達3種人工操縱子都可以明顯提高MK-7的產(chǎn)量。與對照菌株B.subtilis 168相比，3種操縱子中KF的過表達效果最好，MK-7的產(chǎn)量提高了2.63倍，達到了（20.51±1.63）mg/L。過表達人工操縱子AD菌株MK-7產(chǎn)量達到了（15.94±0.30）mg/L，過表達人工操縱子KF的效果強于人工操縱子AD，這一結(jié)果反映出莽草酸的積累量相對充足，而分支酸的量不足。同時也說明，在一定范圍內(nèi)分支酸的積累也會增加MK-7的發(fā)酵產(chǎn)量。過表達人工操縱子HF菌株MK-7產(chǎn)量達到了（17.34±0.65）mg/L，是對照菌株的2.2倍，這就表示HDP的積累會增加MK-7產(chǎn)量的積累。由此可見，以人工操縱子的形式構(gòu)建多基因過表達重組菌株是提高MK-7發(fā)酵產(chǎn)量的一種有效方式。

圖4 過表達不同人工操縱子MK-7產(chǎn)量變化情況Fig.4 Changes of MK-7 production by overexpress different artificial operons

2.4 整合過表達提高MK-7發(fā)酵產(chǎn)量

將上述單因素實驗中最優(yōu)改造進行整合：在菌株MK7-02的基礎(chǔ)上，將menA基因點突變（Q67D）和人工操縱子（KF）連接到帶有麥芽糖啟動子PmalA的pDG質(zhì)粒骨架上得到過表達質(zhì)粒pDGmenA（Q67D）-KF，利用Spizizen轉(zhuǎn)化方法將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MK7-02菌株構(gòu)建得到整合菌株MK7-13。

將整合菌株MK7-13活化后進行發(fā)酵產(chǎn)量驗證。由圖5可以看出，整合菌株MK7-13的MK-7發(fā)酵產(chǎn)量達到了（73.73±1.86）mg/L，與對照菌株相比提高了9.71倍，說明在分支途徑基因敲除菌株MK7-03的基礎(chǔ)上整合過表達可以進一步提高MK-7的發(fā)酵產(chǎn)量。

圖5 整合菌株的MK-7產(chǎn)量驗證結(jié)果Fig.5 Verification result of MK-7 production of integrated strain

3 結(jié)語

MK-7在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[24]，利用微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)MK-7具有重要意義。作者以B.subtilis 168為出發(fā)菌株，利用代謝改造的方法提高了MK-7發(fā)酵產(chǎn)量。在前期工作中分別驗證了敲除分支途徑基因、過表達關(guān)鍵基因menA及menA突變體、構(gòu)建人工操縱子強化部分途徑基因的表達可提升MK-7的發(fā)酵產(chǎn)量。最后結(jié)合上述分支途徑基因敲除、關(guān)鍵基因及突變體過表達、人工操縱子多基因強化表達結(jié)果進行整合構(gòu)建并成功得到高產(chǎn)菌株MK7-13，最終的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到了（73.73±1.86）mg/L。隨著近年來Bacillus subtilis越來越受到廣泛關(guān)注，更多的改造策略與工具被相繼開發(fā)出來。后續(xù)研究中對于MK-7合成競爭途徑、不影響菌體自身生長的副產(chǎn)物代謝途徑的敲除與弱化有望進一步提高MK-7發(fā)酵產(chǎn)量，同時MK-7合成過程中的能量供給、輔因子的形式轉(zhuǎn)換也值得更加深入的探究。后續(xù)工作中需要進行更加系統(tǒng)、全面的菌種改造工作，并結(jié)合工業(yè)化放大培養(yǎng)以期進一步提高MK-7的發(fā)酵產(chǎn)量。