封 弦， 翁佩芳*， 吳祖芳， 李 杲

（1.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832；2.寧波市北侖玉健醫(yī)藥科技有限公司，浙江 寧波 315830）

接骨木（Sambucus nigra）為茜草目忍冬科接骨木屬植物，目前多集中于研究其根莖和花，而對(duì)接骨木果實(shí)的研究較少，僅局限于對(duì)接骨木果油的營(yíng)養(yǎng)和生物活性的研究。接骨木果（Elderberry）富含蛋白質(zhì)[1]、脂肪酸[2-3]、碳水化合物[4-5]、有機(jī)酸和維生素[6]等營(yíng)養(yǎng)成分以及多酚[7]、黃酮[8-9]、花青素[10-11]和酚酸[12]等生物活性物質(zhì)，是一種良好的藥食資源，可用于開發(fā)新的功能食品。

接骨木果中花青素含量較高，故具有顯著的抗氧化能力。Olejnik[13]等使用接骨木果提取物在人結(jié)腸膜細(xì)胞中進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示降低了細(xì)胞中活性氧水平和DNA的損傷，說明接骨木果對(duì)結(jié)腸細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。Wu[11]等研究了15個(gè)水果樣品的抗氧化能力，結(jié)果顯示接骨木果和草莓的抗氧化活性最強(qiáng)。Milbury[14]等研究表明，接骨木果中的花青素的抗氧化能力比維生素C和維生素E強(qiáng)。有研究表明，接骨木果花青素能避免血管上皮細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而防止血管病變[15]。Bratu[16]等研究表明接骨木果的提取物能顯著清除氧自由基。其他研究也表明，接骨木果汁和果酒均具有抗氧化作用，并且接骨木果酒的抗氧化能力與生產(chǎn)過程中所用的糖和水的比例以及果實(shí)的細(xì)度有關(guān)[17-18]。乳酸菌發(fā)酵可以增加果蔬的營(yíng)養(yǎng)和感官特性，延長(zhǎng)貨架期，同時(shí)乳酸菌發(fā)酵也可以促進(jìn)食品中植物化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化[19]，從而產(chǎn)生大量新的代謝產(chǎn)物，因此相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)功能等也會(huì)發(fā)生變化[20]。

H2O2是一種常用的刺激細(xì)胞氧化損傷的工具，它作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷模型可控性強(qiáng)，具有一定的模擬性[21]，因此常應(yīng)用于天然產(chǎn)物抗氧化研究中。

作者選用保加利亞乳桿菌BNCC336436和嗜熱鏈球菌ABT-T發(fā)酵接骨木果汁，通過DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子清除率來判斷接骨木果汁發(fā)酵過程抗氧化活性變化；以未發(fā)酵為對(duì)照，進(jìn)行發(fā)酵接骨木果汁酚類化合物細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)，比較發(fā)酵前后抗氧化活性變化并初步探究抗氧化機(jī)理，為接骨木果汁的發(fā)酵加工和果蔬發(fā)酵功能食品開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

接骨木果粉：寧波市北侖玉健醫(yī)藥科技有限公司提供；保加利亞乳桿菌BNCC336436（Lactobacillus bulgaricus，B）、嗜 熱 鏈 球 菌ABT-T（Streptococcus thermophilus，ST）：均保存于寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；蔗糖：購(gòu)于超市；MRS肉湯培養(yǎng)基、吐溫80、甘油：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HepG2細(xì)胞、PBS緩沖溶液、細(xì)胞凍存液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶緩沖液（EDTA緩沖液）、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒：購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素：購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板、12孔板、96孔板：購(gòu)于寧波航景生物有限公司；CCK-8試劑盒：購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；細(xì)胞活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒：購(gòu)于南京建成生物有限公司；qPCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物：購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA提取試劑盒 （HiPure Bacterial RNA Kit，R4182）：購(gòu)于廣州美基生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（UEIrisⅡIRT-PCR Svstem for First-StrandcDNA Svnthesis，R2028）：購(gòu)于蘇州宇恒生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒（PerfectStarrTM Green qPCR SuperMix）：購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ZJ-HCB-1200潔凈工作臺(tái)：廣州梓凈凈化設(shè)備有限公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱：江南儀器廠；5418R低溫超速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；311型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱、1300系列A2型生物安全柜、MK3酶標(biāo)儀：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；XSP-63XDV熒光倒置顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；HWS-11恒溫水浴鍋：上海慧泰儀器制造有限公司；LDZX-40B I型立式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DM-40L262-40℃冰箱：青島海爾特種電器有限公司；-80℃超低溫冰箱：賽默飛科技（蘇州）有限公司；qPCR儀：武漢俊杰電子有限公司；BD-252WY-20℃冰箱：容聲冰箱有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化取新鮮保藏的B和ST試管斜面分別接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)18 h得到菌種活化液，備用。

1.3.2 發(fā)酵接骨木果汁的制備按料液質(zhì)量體積比1 g∶50 mL配制接骨木果汁，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的蔗糖，經(jīng)85℃水浴滅菌15 min后降至室溫得到發(fā)酵基質(zhì)。將B和ST按體積分?jǐn)?shù)3%接入發(fā)酵基質(zhì)中，于37℃恒溫靜置發(fā)酵36 h。

1.3.3 發(fā)酵接骨木果汁酚類化合物的提取與純化分別取一定量的未發(fā)酵和發(fā)酵接骨木果汁與無水乙醇按體積比1∶1混合均勻，然后超聲提取30 min（功率40 W，溫度40℃）后過濾，得到的濾渣再按體積比1∶1的比例加入無水乙醇進(jìn)行提取，重復(fù)提取3次，將收集到的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，即得到酚類化合物的粗提取物，于4℃保存待純化。 采用AB-8大孔吸附樹脂對(duì)接骨木果汁酚類化合物的粗提取物進(jìn)行純化。具體操作步驟為：1）AB-8大孔吸附樹脂經(jīng)無水乙醇浸泡24 h使其活化，用蒸餾水沖洗至無醇味；2）取適量烘干活化好的AB-8樹脂倒入燒杯中備用；3）在燒杯中加入酚類物質(zhì)粗提取物濃縮液、無水乙醇和AB-8大孔樹脂，攪拌均勻放置磁力攪拌器攪拌過夜；4）收集乙醇洗脫液，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，備用；5）經(jīng)冷凍干燥后得到接骨木果汁的酚類化合物純化物。

1.3.4 DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基清除能力的測(cè)定DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照馮文娟[22]等的方法；超氧陰離子清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]的方法；羥自由基清除能力的測(cè)定參考鄭時(shí)蓮[24]等的方法。

1.3.5 α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)α-淀粉酶抑制率用3，5-二硝基水楊酸試劑法測(cè)定[25]。稱取α-淀粉酶粉末用pH 6.8的PBS溶液配制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的α-淀粉酶溶液。取1 mL樣品與1 mL α-淀粉酶溶液，搖勻，25℃靜置反應(yīng)10 min。隨后加入1 mL體積分?jǐn)?shù)1%可溶性淀粉（pH 6.8的PBS溶液溶解），再加入1 mL DNS溶液沸水浴5 min進(jìn)行顯色反應(yīng)，冷卻至室溫。加入蒸餾水稀釋至10 mL，540 nm處檢測(cè)吸光值，空白組以蒸餾水做對(duì)照。

式中：Ac為空白組吸光值，As為樣品組吸光值。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)α-葡萄糖苷酶抑制率參考Marilisa[26]的方法，稍做修改。具體操作為：分別取1 mL磷酸鹽緩沖液、0.2 mL α-葡萄糖苷酶溶液、0.4 mL果汁發(fā)酵液加入試管中搖勻，37℃水浴10 min，加入0.5 mL pNPG溶液搖勻，再于37℃水浴10 min，最后加入8 mL Na2CO3溶液，于405 nm處測(cè)定其吸光值，結(jié)果記為A1。取2支試管做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中不加底物pNPG的試管吸光值記為A2，另一支不加果汁的試管吸光值記為A3。

式中：A1為添加α-葡萄糖苷酶溶液、果汁和底物pNPG的吸光值，A2為添加α-葡萄糖苷酶溶液和果汁的吸光值，A3為添加α-葡萄糖苷酶溶液和底物pNPG的吸光值。

1.3.7 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代將HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至狀態(tài)良好后灌滿培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到生物安全柜中操作。如細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%，將瓶中的培養(yǎng)基移入無菌瓶中留作培養(yǎng)使用，保留5~8 mL培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至90%~100%后，按要求消化傳代。棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞用無菌PBS緩沖液清洗2次，加入適量胰蛋白酶消化，待細(xì)胞完全脫壁后加入培養(yǎng)基吹打均勻，分瓶培養(yǎng)，按需傳代或鋪板。

1.3.8 細(xì)胞凍存將培養(yǎng)至90%~100%的HepG2細(xì)胞于生物安全柜中棄掉舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗2遍，然后加入適量0.25% EDTA溶液消化2~3 min后，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化。最后將細(xì)胞收集至15 mL離心管中，于1 000 r/min離心5 min，棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)胞凍存液（提前預(yù)冷）加入細(xì)胞中，吹打之后分裝到2 mL細(xì)胞凍存管中，寫好標(biāo)簽后，用封口膜封好，最后放至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.3.9 建立HepG2細(xì)胞氧化損傷模型以未經(jīng)過樣品和H2O2處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，經(jīng)過不同濃度的H2O2處理的細(xì)胞為模型組，經(jīng)過樣品處理再經(jīng)過H2O2處理的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。選擇質(zhì)量濃度0、125、250、500、1 000 μg/mL的H2O2溶液（DMEM培養(yǎng)基配制）作為本實(shí)驗(yàn)濃度，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，每個(gè)孔中加入200 μL細(xì)胞懸液后置于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗1次，每個(gè)孔中加入不同質(zhì)量濃度的200 μL H2O2溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后測(cè)定細(xì)胞存活率，獲得HepG2細(xì)胞氧化損傷模型。

1.3.10 HepG2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)按照CCK-8試劑盒步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 ROS、LDH、T-AOC和CAT活力的測(cè)定取適量經(jīng)過處理的細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照相應(yīng)的測(cè)定試劑盒測(cè)定步驟進(jìn)行。其中ROS以熒光強(qiáng)度計(jì)，LDH用相對(duì)釋放率表示，T-AOC單位為U/mL，CAT其活力單位為U/mL。

1.3.12 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集各組細(xì)胞?？俁NA的提取根據(jù)RNA提取試劑盒提供的方法執(zhí)行，接著使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。GAPDH購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號(hào)B661104。

表1 qPCR引物序列Table 1 Sequence of qPCR primer

1.3.13 數(shù)據(jù)分析每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁體外抗氧化活性變化

乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁過程中抗氧化能力的變化見圖1?？梢钥闯?，發(fā)酵接骨木果汁對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除能力呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加對(duì)自由基的清除率提高，且發(fā)酵結(jié)束時(shí)接骨木果汁的抗氧化能力最大。經(jīng)菌種B和ST發(fā)酵后，接骨木果汁對(duì)DPPH自由基的清除能力從44.67%提高到了60.76%，對(duì)羥自由基清除率達(dá)到了75.37%，較未發(fā)酵果汁提高了20.39%，對(duì)超氧陰離子的清除能力從43.27%增加到了57.45%，表明接骨木果汁經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后提高了抗氧化能力。這可能是由于乳酸菌發(fā)酵過程中發(fā)酵基質(zhì)中酚類和黃酮類化合物的釋放以及乳酸菌分泌的抗氧化酶的抗氧化能力不同引起的。延莎[27]等使用乳酸菌發(fā)酵茶花粉后發(fā)現(xiàn)其總多酚和總黃酮含量都有明顯的增加，發(fā)酵茶花粉提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基等自由基的清除能力均高于對(duì)照組。沙棘-蘋果汁的復(fù)合果汁經(jīng)不同種類乳酸菌發(fā)酵后，植物乳桿菌對(duì)其黃酮醇含量和抗氧化能力的提高更為明顯[28]。乳清蛋白藍(lán)莓汁混合物經(jīng)保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌單獨(dú)發(fā)酵和混菌發(fā)酵后對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基清除率和脂質(zhì)過氧化能力與發(fā)酵前相比均有提高[29]。

圖1 接骨木果汁發(fā)酵過程中DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子清除率的變化Fig.1 Changes in the scavenging rates of DPPH radicals，hydroxyl radicals and superoxide anions during the fermentation of elderberry juice

2.2 酶抑制實(shí)驗(yàn)

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶可以分解碳水化合物，從而增加人體血糖水平，通過抑制這兩種酶的活性可以有效地延緩糖類的水解從而起到降低血糖的作用。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵接骨木果汁過程中對(duì)這2種酶抑制能力變化見圖2。從圖2可以看出，發(fā)酵接骨木果汁對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；經(jīng)36 h的發(fā)酵，接骨木果汁對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率從52.97%提高至72.39%，對(duì)α-淀粉酶的抑制率從48.75%增加到68.62%，表明乳酸菌發(fā)酵有效提高了接骨木果汁的酶抑制能力。有文獻(xiàn)報(bào)道，Aronia果汁經(jīng)發(fā)酵后具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性[30]。李云姣[31]等發(fā)現(xiàn)，水果酵素在發(fā)酵120 d后對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分別達(dá)到了99.57%和81.67%，證明水果酵素具有良好的降血糖作用。有研究表明，采用植物乳桿菌發(fā)酵黑葡萄汁后對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性顯著提高[32]。南瓜乳酸菌發(fā)酵飲料對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到（95.89±0.03）%[33]，證明南瓜經(jīng)乳酸菌發(fā)酵可用于開發(fā)降糖飲料。

圖2 接骨木果汁發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力的變化Fig.2 Changes in the inhibitory capacity of α-glucosidase and α-amylase during the fermentation of elderberry juice

2.3 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁酚類化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用

不同質(zhì)量濃度酚類物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞存活率見圖3。可以看出，發(fā)酵前后的接骨木果汁酚類化合物質(zhì)量濃度在0~500 μg/mL范圍內(nèi)作用于HepG2細(xì)胞，細(xì)胞存活率均在85%以上，說明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酚類化合物對(duì)HepG2細(xì)胞無明顯毒性作用。

圖3 不同質(zhì)量濃度接骨木果汁酚類物質(zhì)作用下的HepG2細(xì)胞存活率Fig.3 Survival of HepG2 cells under the different mass concentrations of phenolic substances of elderberry juice

2.4 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷質(zhì)量濃度的確定

為了確定H2O2的刺激濃度，選取質(zhì)量濃度0、125、250、500、1 000 μg/mL的H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行氧化刺激，不同質(zhì)量濃度作用下HepG2細(xì)胞存活率見圖4。從圖4可以看出，H2O2質(zhì)量濃度在0、125、250 μg/mL下HepG2細(xì)胞存活率都在80%以上，說明該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞沒有造成氧化損傷；而在500、1 000 μg/mL質(zhì)量濃度刺激下，HepG2細(xì)胞存活率分別為47.31%和31.27%，如果細(xì)胞存活率太高或太低，那么樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的作用效果就會(huì)不明顯，參考意義不大[34]。因此選擇刺激條件下細(xì)胞存活率接近50%的H2O2質(zhì)量濃度進(jìn)行下一步分析。

圖4 不同質(zhì)量濃度H2O2刺激下HepG2細(xì)胞存活率Fig.4 Survival rate of HepG2 cells under different mass concentrations of H2O2 stimulation

2.5 接骨木果汁酚類物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

通過實(shí)驗(yàn)篩選了誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的H2O2質(zhì)量濃度。從圖5可以看出，在質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500 μg/mL未發(fā)酵和發(fā)酵接骨木果汁酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度作用下，HepG2細(xì)胞的存活率都高于刺激組，說明酚類物質(zhì)可有效降低H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化損傷程度。而在200 μg/mL和300 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率接近85%，有利于下一步實(shí)驗(yàn)的開展。為了確保下一步實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，作者研究了200 μg/mL和300 μg/mL接骨木果汁酚類物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

圖5 不同質(zhì)量濃度酚類物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞的存活率Fig.5 Survival rate of HepG2 cells under the effect of different mass concentrations of phenolic substances

2.6 ROS、T-AOC、CAT、LDH的測(cè)定

不同處理?xiàng)l件下HepG2細(xì)胞中ROS水平的變化見圖6?？梢钥闯觯c空白組相比，僅添加H2O2處理后提高了HepG2細(xì)胞中ROS的水平，說明促進(jìn)了氧化應(yīng)激的發(fā)生；而HepG2細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質(zhì)預(yù)處理后明顯減弱了氧化應(yīng)激作用，抑制了ROS的積累，說明酚類物質(zhì)在一定程度上起到了保護(hù)作用。為了探究接骨木果汁酚類物質(zhì)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，HepG2細(xì)胞先用酚類物質(zhì)預(yù)處理24 h，然后測(cè)定HepG2細(xì)胞T-AOC、CAT和LDH相對(duì)釋放率的變化，結(jié)果見圖6。經(jīng)質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞總抗氧化能力顯著提高，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，說明酚類物質(zhì)的作用降低了HepG2細(xì)胞的氧化損傷程度。發(fā)酵接骨木果汁酚類物質(zhì)的總抗氧化能力比未發(fā)酵酚類物質(zhì)強(qiáng)。同時(shí)，用質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞的過氧化氫酶活力顯著高于對(duì)照組，說明酚類物質(zhì)可以有效降低H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激。乳酸脫氫酶的釋放可能是因?yàn)樵贖2O2的刺激下細(xì)胞膜受到損傷，通透性增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞中乳酸脫氫酶濃度的增加。如圖6所示，用質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞的乳酸脫氫酶相對(duì)釋放率明顯高于空白組，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組。這些都說明酚類物質(zhì)在一定程度上降低了H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞膜的破壞。

圖6 不同質(zhì)量濃度酚類物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞ROS、T-AOC、CAT和LDH的變化Fig.6 Changes of ROS，T-AOC，CAT and LDH in HepG2 cells under the different mass concentrations of phenolic substances

2.7 抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的變化

抗氧化酶可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害，抑制細(xì)胞中ROS的過量生成，以維持細(xì)胞氧化還原平衡。同時(shí)，抗氧化酶可以將過氧化物轉(zhuǎn)化為毒性較小或無害的物質(zhì)。通過測(cè)定HO-1、NQO1和GCLC基因相對(duì)表達(dá)量，證明酚類物質(zhì)處理后是否提高了相關(guān)酶的抗氧化活性。HO-1可以催化血紅素分解，生成的小分子產(chǎn)物具有抗氧化損傷的功能[35]，是一種重要的抗氧化酶。如圖7所示，HO-1的基因表達(dá)在經(jīng)H2O2處理的HepG2細(xì)胞中明顯降低，而在經(jīng)200、300 μg/mL酚類物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中明顯提高。NQO1可以通過還原反應(yīng)降低ROS的產(chǎn)生，因此NQO1能阻止外源性刺激條件對(duì)DNA造成氧化損傷，是重要的抗氧化酶之一。在H2O2刺激下HepG2細(xì)胞中的NQO1基因表達(dá)量減少，而采用質(zhì)量濃度為200、300 μg/mL酚類物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中NQO1基因表達(dá)量明顯增加。同時(shí)，經(jīng)H2O2刺激后HepG2細(xì)胞中GCLC表達(dá)量減少，使用質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中NQO1基因表達(dá)量上升。因此可以說明酚類物質(zhì)可以加強(qiáng)HepG2細(xì)胞中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量。

圖7 不同質(zhì)量濃度酚類物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞氧化損傷模型中的抗氧化酶相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)Fig.7 Relative expression of antioxidant enzyme-related genes in a model of oxidative damage in HepG2 cells under the different phenolic substance mass concentrations

3 結(jié)語(yǔ)

選用B和ST發(fā)酵接骨木果汁后，果汁的抗氧化活性提高，對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力也提高。研究還表明，用酚類物質(zhì)預(yù)處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞T-AOC、CAT明顯提高；LDH相對(duì)釋放率明顯增加并且降低了細(xì)胞中活性氧的積累；這說明酚類物質(zhì)能使HepG2細(xì)胞免受H2O2氧化損傷，并且發(fā)酵后的酚類物質(zhì)作用比發(fā)酵前強(qiáng)。細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)證明，HO-1、NQO1和GCLC相關(guān)抗氧化酶的基因表達(dá)在經(jīng)H2O2處理的HepG2細(xì)胞中明顯降低，而經(jīng)酚類物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中明顯提高。由此可見，發(fā)酵后果汁抗氧化能力提高的原因可能是在酚類物質(zhì)的作用下提高了HepG2細(xì)胞中相關(guān)抗氧化酶的基因表達(dá)水平。