◎ 王 震

（諾安實(shí)力可商品檢驗(yàn)（上海）有限公司，上海 201112）

紅曲色素是以大米或大豆為主要原料，由曲霉屬中的紅曲霉、變紅紅曲霉、紫紅紅曲霉和馬米加紅曲霉等菌種發(fā)酵提取后得到的一種天然色素，為深紫紅色粉末，其中已知成分包含紅、黃、橙3種色系10種化合物。作為一種天然的食品色素添加劑，紅曲色素在食品中少量的添加對(duì)人體危害較小，性甘、溫、無(wú)毒，并且具有利于消化、降脂、活血等功效，除了可作為著色劑使用，還具有一定的抗菌作用。有研究表明其對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、灰色鏈霉菌以及大腸桿菌具有一定的抑制作用。紅曲色素中含有多種化合物，在水及醇等有機(jī)試劑中都具有溶解性，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。本次試驗(yàn)針對(duì)其中6種化合物，包括潘紅胺、紅曲紅胺、紅曲素、紅斑素、紅曲黃素以及紅曲紅玉素進(jìn)行研究，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 6種紅曲色素結(jié)構(gòu)式圖

目前國(guó)內(nèi)針對(duì)食品中紅曲色素的測(cè)定方法不多，且方法中可參考測(cè)定的目標(biāo)化合物較少，紅曲色素的添加量在食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中有限量要求[1-3]。目前，國(guó)內(nèi)紅曲色素檢測(cè)方法有液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法兩種。液相色譜法是目前使用較多的方法，但其抗基質(zhì)干擾能力差，前處理操作步驟煩瑣，耗時(shí)費(fèi)力，化合物的靈敏度和準(zhǔn)確性低于質(zhì)譜法[4-7]。本文通過提取液直接提取，節(jié)約了樣品前處理時(shí)間，提高檢測(cè)效率。利用反相C18色譜柱分離番茄醬中的潘紅胺、紅曲紅胺、紅曲素、紅斑素、紅曲黃素以及紅曲玉紅素6種成分，通過優(yōu)化液相流動(dòng)相的梯度洗脫程序以去除基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾、改善色譜峰峰型，并用質(zhì)譜檢測(cè)器在正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)測(cè)定其含量，為食品安全的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

測(cè)試原理參考《出口食品中紅曲色素的測(cè)定》 （SN/T 3843—2014）[1]，番茄醬中的紅曲色素用乙腈水溶液分別提取其中的水溶性色素及脂溶性色素，離心過濾后待上機(jī)。用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在空白的樣品基質(zhì)中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，并用相同的提取方法提取溶液用以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用LC- MS/MS 測(cè)定確認(rèn)。使用標(biāo)準(zhǔn)品線性的最低點(diǎn)、中間點(diǎn)、最高點(diǎn)濃度加標(biāo)3 平行并重復(fù)測(cè)試兩天，同時(shí)測(cè)定樣品空白，以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性、重現(xiàn)性與定量限。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

潘紅胺（Rubropunctamine）標(biāo)準(zhǔn)品：有證標(biāo)準(zhǔn)品，分子式為C21H23NO4，純度≥95%，CAS 514-66-9，購(gòu)自Carbosynth；紅曲紅胺（N-Fmoc-8-aminooctanoic acid）標(biāo)準(zhǔn)品：有證標(biāo)準(zhǔn)品，分子式為C23H27NO4，純度≥99%，CAS 126631-93-4，購(gòu)自上海安普實(shí)驗(yàn)科技；紅曲素（Monascin）標(biāo)準(zhǔn)品：有證標(biāo)準(zhǔn)品，分子式為C21H26O5，純度≥98%，CAS 21516-68-7，購(gòu)自成都樂美天醫(yī)藥科技；紅斑素（Rubropunctatin）標(biāo)準(zhǔn)品：有證標(biāo)準(zhǔn)品，分子式為C21H22O5，純度≥ 95%，CAS 514-67-0，購(gòu)自深圳東方藍(lán)泰科技；紅曲黃素（Ankaflavin）標(biāo)準(zhǔn)品：有證標(biāo)準(zhǔn)品，分子式為C23H30O5，純 度≥98%，CAS 50980-32-0，購(gòu) 自Carbosynth；紅曲玉紅素（Monascorubrin）標(biāo)準(zhǔn)品：有證標(biāo)準(zhǔn)品，分子式為C23H26O5，純度≥94%，CAS 13283-90-4，購(gòu)自深圳東方藍(lán)泰科技；乙腈、甲酸，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；水，二級(jí)水（GB/T 6682—2008）。

1.3 儀器與設(shè)備

本試驗(yàn)用到的主要儀器與設(shè)備見表1。

表1 儀器與設(shè)備表

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品提取

稱量10.0 g 番茄醬樣品于50 mL 離心管中。加入40 mL 乙腈水（v∶v=9 ∶1）提取液，漩渦混勻后，置于臺(tái)式振蕩器中振蕩1 h。置于高速離心機(jī)中于 4 000 r·min-1離心10 min 后，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，再次加入適量乙腈水（v∶v=9 ∶1）提取液重復(fù)提取樣品兩次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙腈水定容至刻度。取上清液過膜后待液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上機(jī)分析。

1.4.2 紅曲素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

取5 份空白樣品，分別加入10 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)品混合 溶 液0.300 mL、0.200 mL、0.100 mL、0.050 mL、 0.025 mL 和0.010 mL 按樣品前處理操作進(jìn)行提取，過膜后得到0.001 ～0.030 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.3 儀器條件

液相條件：流動(dòng)相梯度程序見表2；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL·min-1；離子源模式：ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，MRM；離子源溫度：325 ℃；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：10 L·min-1；離子源噴霧電 源：5 500 V；色譜柱：ChormCore C18（2.1 mm×150 mm，3 μm）。納譜分析，質(zhì)譜條件見表3。

表2 梯度參考條件表

表3 6種紅曲色素質(zhì)譜條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水作為液相系統(tǒng)的流動(dòng)相，用梯度洗脫方式在反相C18色譜柱中分離基質(zhì)干擾和不同的目標(biāo)物，初始流動(dòng)相的比例以高水相為主（80%水相），后用梯度洗脫系統(tǒng)提高有機(jī)相比例使目標(biāo)物在合適的時(shí)間出峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜峰的峰型窄、沒有分叉和拖尾，見圖2。目標(biāo)物全部出峰后用更高的有機(jī)相比例（90%有機(jī)相），可以有效去除基質(zhì)中的雜質(zhì)，防止干擾下一針的進(jìn)樣圖譜。

圖2 6種紅曲色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

對(duì)于質(zhì)譜檢測(cè)器條件而言，由于本次試驗(yàn)的6種目標(biāo)化合物在離子源中的加電模式均為[M+H]+形式，在乙腈和水中加入微量的甲酸可以有效提高目標(biāo)化合物的離子化效率和靈敏度。同時(shí)為了提高各個(gè)化合物的響應(yīng)，在MS 信號(hào)采集時(shí)可以設(shè)定保留時(shí)間分段采集信號(hào)，每個(gè)化合物的采集信號(hào)可設(shè)定為（RT±0.5）min，各個(gè)化合物的最低點(diǎn)濃度的色譜峰均超過10 倍信噪比。在全部化合物出峰后將MS 進(jìn)樣狀態(tài)設(shè)定成“waste”可以有效減少離子源和四極桿的污染。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)色譜圖（見圖3），讀取色譜峰面積值，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在0.001 0 ～0.030 0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，6 個(gè)化合物的校準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均滿足大于0.995 的要求[8]，說(shuō)明線性在該定量范圍符合標(biāo)準(zhǔn)要求，具體見圖3。

圖3 6種紅曲色素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

取番茄醬空白基質(zhì)樣品，準(zhǔn)確稱取10 份，一份不加入標(biāo)準(zhǔn)品作為基質(zhì)空白，其他9 份分別在每份樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各3份，按照1.4.1 的試驗(yàn)步驟測(cè)定樣品后，在液相色譜儀質(zhì)譜檢測(cè)器上讀取峰面積，計(jì)算含量結(jié)果，線性同樣品前處理上機(jī)測(cè)定，通過兩天測(cè)定空白基質(zhì)，樣品圖譜中6種紅曲色素沒有陽(yáng)性峰，基質(zhì)樣品中也沒有數(shù)值 （見表4），故基質(zhì)對(duì)加標(biāo)沒有干擾。通過3 個(gè)濃度點(diǎn)的基質(zhì)加標(biāo)并測(cè)試兩天，觀察兩天測(cè)試結(jié)果的回收率，對(duì)方法的重復(fù)性與重現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證，數(shù)據(jù)見表4。不同濃度的回收率的平均值均滿足80%～110%的要求，說(shuō)明準(zhǔn)確度符合標(biāo)準(zhǔn)要求[8]。基質(zhì)每個(gè)加標(biāo)水平的回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足小于15%的要求，精密度符合標(biāo)準(zhǔn)要求[8]。

表4 基質(zhì)加標(biāo)回收結(jié)果表

2.4 檢出限

基質(zhì)最低加標(biāo)水平0.010 mg·kg-1能同時(shí)滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求，滿足測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)的要求，故將最低加標(biāo)值0.010 mg·kg-1作為此次驗(yàn)證的檢出限，滿足食品中添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)限量標(biāo)準(zhǔn)的最低含量要求[9]。

3 結(jié)論

從本次試驗(yàn)結(jié)果可以看出采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜串聯(lián)法可以準(zhǔn)確測(cè)定番茄醬中六種紅曲色素的含量，方法準(zhǔn)確性和精密度均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，檢出限也能符合國(guó)內(nèi)添加劑使用量的要求。本文通過使用LC-MS/MS 方法解決了采用常規(guī)液相色譜檢測(cè)中前處理操作步驟煩瑣、抗干擾能力弱、靈敏度和準(zhǔn)確性差的問題，并在國(guó)內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上新增了幾種目標(biāo)化合物，不僅提高了檢測(cè)效率，還為國(guó)內(nèi)對(duì)紅曲色素的研究提供參考。