朱欣穎，胡 云，王耀輝，吳志浩，余方流

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；2.臨床醫(yī)學(xué)院；3.醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

2018年全世界因肺癌死亡人數(shù)約180萬(wàn)，是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，我國(guó)肺癌的發(fā)病率居于所有癌癥首位[2]。相比傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放射線治療和化學(xué)藥物治療，天然抗腫瘤靶向藥物具有定位精準(zhǔn)、針對(duì)性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[3]，因此，尋找新的天然藥物制劑對(duì)人類癌癥的治療是非常必要的。大葉茜草素(mollugin)是一種從茜草中分離出的萘醌類化合物，可用于治療結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎癥和子宮炎等[4-5]。有研究表明大葉茜草素具有多種生物抗腫瘤活性，但是其抗腫瘤機(jī)制尚未完全闡明。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞失去頂端-基底極性和細(xì)胞-細(xì)胞黏附，向侵襲性間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程，在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究對(duì)大葉茜草素抑制肺癌A549、H1299細(xì)胞的增殖和遷移作用進(jìn)行了初步探討，為大葉茜草素的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 A549、H1299細(xì)胞(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，ATCC)

1.1.2 主要試劑與儀器 大葉茜草素(成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)PS000268)；pRL-CMV質(zhì)粒(Promega，美國(guó))；糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制劑(MCE，美國(guó))；Snail抗體、Fibronectin抗體、E-cadherin抗體、Vimentin抗體、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抗體、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(pGSK-3β)抗體、β-catenin抗體(CST，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從-80℃冰箱中取出凍存的A549、H1299細(xì)胞，復(fù)蘇后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 大葉茜草素溶液的配制 精確稱取大葉茜草素25 mg，溶于880 μL二甲基亞砜(DMSO)中，配置成0.1 mol/L高濃度原液，使用時(shí)稀釋至20 mmol/L，根據(jù)實(shí)驗(yàn)濃度加入培養(yǎng)基中。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞均勻接種于48孔板中，細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至80%時(shí)，使用雙無(wú)培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜，對(duì)照組僅加入藥物溶劑DMSO，大葉茜草素組加入藥物濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L，每樣本設(shè)置4組副孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，4 h后每孔加入300 μL的DMSO，室溫下避光震蕩15 min至結(jié)晶沉淀徹底溶解，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)得其吸光度OD值。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式如下：細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，使用雙無(wú)培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜，用200 μL槍頭在細(xì)胞表面劃出一條線，大葉茜草素組加入藥物濃度為20、40 μmol/L，在大葉茜草素處理0、24、48 h時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞劃痕并測(cè)量劃痕的寬度。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，使用雙無(wú)培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜。大葉茜草素組加入藥物濃度為20、40、60 μmol/L，24 h后加入的Laemmli sample buffer裂解液收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜75 min，剪出相應(yīng)條帶，牛奶封閉1 h，4℃一抗孵育過(guò)夜，次日室溫下孵育二抗1 h，在AI6000化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影。按上述方法提取蛋白樣品3次進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 過(guò)表達(dá)GSK-3β質(zhì)粒實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右開始轉(zhuǎn)染，對(duì)照組中加入pcDNA 3.1，過(guò)表達(dá)組中加入載體和GSK-3β質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染36 h后饑餓細(xì)胞過(guò)夜，大葉茜草素組藥物濃度為20、40 μmol/L，作用24 h后收集蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 GSK-3β抑制劑恢復(fù)實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，使用雙無(wú)培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜。將細(xì)胞分組為對(duì)照組、大葉茜草素組(藥物濃度為40 μmol/L)、GSK-3β抑制劑組(藥物濃度為40 μmol/L，抑制劑濃度為20 μmol/L)。分別加入40 μmol/L大葉茜草素，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)18 h后在GSK-3β抑制劑組中加入20 μmol/L的GSK-3β抑制劑，處理6 h后收集細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 大葉茜草素對(duì)A549、H1299、HBE細(xì)胞增殖的影響 用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定大葉茜草素對(duì)肺癌細(xì)胞A549、H1299、人支氣管上皮細(xì)胞HBE增殖的影響。不同濃度大葉茜草素(10、20、40、80、160 μmol/L)加入細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，40～160 μmol/L的大葉茜草素可以抑制A549細(xì)胞增殖(P<0.05)，10～160 μmol/L的大葉茜草素能夠抑制H1299細(xì)胞增殖(P<0.05)；而對(duì)HBE細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響(P>0.05)，見圖1。

與Mollugin 0 μmol/L相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 大葉茜草素對(duì)A549、H1299細(xì)胞遷移的影響 與對(duì)照組相比，在A549細(xì)胞中，大葉茜草素作用24 h或48 h后，均可明顯抑制細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)；在H1299細(xì)胞中，藥物作用48 h后，細(xì)胞的遷移能力受到抑制(P<0.05)，見圖2。

與Mollugin 0 μmol/L相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 大葉茜草素抑制肺癌A549、H1299細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，大葉茜草素組Fibronectin、Vimentin和Snail表達(dá)量均下降(P<0.01)；而E-cadherin表達(dá)量增高(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

與Mollugin 0 μmol/L相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 大葉茜草素下調(diào)Wnt/β-catenin通路信號(hào)蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，大葉茜草素組pGSK-3、β-catenin蛋白表達(dá)均下降(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

2.5 大葉茜草素通過(guò)影響Wnt/β-catenin通路抑制肺癌A549、H1299細(xì)胞的EMT Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后EMT相關(guān)蛋白(Fibronectin、Vimentin、Snail)表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；E-cadherin表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證大葉茜草素是否通過(guò)GSK-3β影響肺癌細(xì)胞的EMT，在GSK-3β抑制劑恢復(fù)實(shí)驗(yàn)中，將40 μmol/L大葉茜草素和20 μmol/L GSK-3β抑制劑共同作用，Western blot結(jié)果顯示，加入GSK-3β抑制劑后，pGSK-3β、β-catenin表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞的EMT相關(guān)蛋白(Fibronectin、Vimentin、snail)表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

3 討論

肺癌是世界上最常見的癌癥，每年約有200萬(wàn)例患者，導(dǎo)致近180萬(wàn)人死亡，其發(fā)病率和病死率分別占全球總癌癥的11.6%和18.4%[1]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，所有肺癌患者中約80%～90%是NSCLC。半數(shù)以上的肺癌患者在確診后1年內(nèi)死亡，5年生存率約為21%[6]。已有研究表明，天然藥物衍生的植物化學(xué)物質(zhì)在NSCLC治療中表現(xiàn)出較小毒副作用，且能有效提高患者的生存率[3]，因此尋找新的藥物作用靶點(diǎn)和靶向藥物成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。

大葉茜草素是一種從茜草中分離得到的萘醌類化合物[7]，已被證實(shí)具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等生物活性作用[4-5,8]，但其抗腫瘤機(jī)制尚未完全闡明。腫瘤轉(zhuǎn)移是晚期癌癥的標(biāo)志，也是治療上的一大挑戰(zhàn)。EMT在傷口愈合、纖維化和癌癥進(jìn)展中起著極為重要的作用[9-11]。EMT的一個(gè)標(biāo)志是上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin的下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞黏附的不穩(wěn)定，E-cadherin在質(zhì)膜處被裂解后降解，因此β-catenin不能再與E-cadherin相互作用，進(jìn)而可以進(jìn)入Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用[12]。Snail是涉及上皮表型抑制和間充質(zhì)表型激活的基因表達(dá)變化的主要調(diào)節(jié)因子，Snail結(jié)合于E-cadherin啟動(dòng)子上，抑制基因的表達(dá)[13]，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞發(fā)生EMT。有研究表明，細(xì)胞表面Fibronectin可以促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，與增殖、遷移、腫瘤的大小和血管生成等密切相關(guān)[14]。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞顯示E-cadherin的表達(dá)降低，而Fibronectin、N-cadherin、Vimentin和EMT核心轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)增加，發(fā)生EMT期間基因的變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生變化，如細(xì)胞形態(tài)改變、黏附喪失等[15]。EMT已知與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路也被稱為典型的Wnt通路，Wnt信號(hào)通路激活后，破壞復(fù)合物(由GSK-3β、CKIα、Axin和APC構(gòu)成)被募集到Wnt受體復(fù)合物上并失活，促進(jìn)β-catenin積累并進(jìn)入細(xì)胞核，并作為轉(zhuǎn)錄因子激活Snail的轉(zhuǎn)錄[16]。β-catenin受到GSK-3β的抑制，其可以被GSK-3β介導(dǎo)的磷酸化滅活進(jìn)而降解，失去對(duì)EMT的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示，大葉茜草素可以抑制肺癌A549、H1299細(xì)胞的增殖和遷移，并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。過(guò)表達(dá)GSK-3β質(zhì)粒后加入大葉茜草素，蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，纖維粘結(jié)蛋白Fibronectin、間充質(zhì)標(biāo)記蛋白Vimentin和EMT主要轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)進(jìn)一步降低，上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)進(jìn)一步增高，這表明A549、H1299細(xì)胞的EMT受到了抑制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證大葉茜草素通過(guò)Wnt/β-catenin通路參與了EMT進(jìn)程，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，加入了GSK-3β抑制劑，結(jié)果顯示，F(xiàn)ibronectin、Vimentin、Snail表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的EMT得到恢復(fù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探究了大葉茜草素通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路使肺癌細(xì)胞A549、H1299的EMT受阻，從而抑制細(xì)胞遷移，為大葉茜草素的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)仍需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)的佐證，有關(guān)大葉茜草素的具體分子機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步的探討，后期將研究大葉茜草素通過(guò)何種信號(hào)分子從而調(diào)控Wnt/β-catenin。