鐘文華，劉 云，溫俊威，吳 超，洪 云，王 林，李 曙

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 超聲醫(yī)學(xué)科，安徽 蕪湖 241001)

當(dāng)缺血的組織血液供應(yīng)恢復(fù)，產(chǎn)生大量的自由基等所造成的損傷稱為缺血再灌注損傷(ischemical reperfusion injury，IRI)[1-2]。機(jī)體中血管內(nèi)皮細(xì)胞是IRI的前沿細(xì)胞，體外缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical rein endothelial cells,HUVECs)損傷模擬體內(nèi)IRI。本研究擬采用自制的簡(jiǎn)易密封盒構(gòu)建缺氧環(huán)境，建立HUVECs H/R損傷模型,并探討該建模方法的可行性與可重復(fù)性[3]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 HUVECs細(xì)胞系，購(gòu)于上海酶研生物科技有限公司。

1.2 試劑 FPS、DMEM培養(yǎng)基(含1.0、4.5 g/L D-Glucose)購(gòu)于Gibco公司(美國(guó))；蜂蠟購(gòu)于Solarbio公司(中國(guó))；密封盒購(gòu)于安扣旗艦店(中國(guó))；Hoechest 33258試劑、QuickBlockTMWestern封閉液和DCFH-DA試劑盒購(gòu)于碧云天(中國(guó))。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(THERMO，美國(guó))；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX51，日本)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士)；測(cè)氧儀CY-12C(佳長(zhǎng)電子科技，中國(guó))。

1.4 H/R模型建立及分組 參照文獻(xiàn)[4]HUVECs消化，75%細(xì)胞變圓，滴加完全培養(yǎng)基，吹打混勻，種于6孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%后，實(shí)驗(yàn)組更換低糖無(wú)血清培養(yǎng)基，放到自制的密封盒里，再將密封盒放到CO2培養(yǎng)箱里，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分別缺氧3、6、9、12 h。缺氧處理結(jié)束后，洗凈，滴加完全培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。對(duì)照組(Control組)細(xì)胞正常培養(yǎng)、換液，不進(jìn)行其他處理。

本實(shí)驗(yàn)缺氧環(huán)境使用的是奶粉盒、氧氣檢測(cè)儀共同構(gòu)建的，奶粉盒本身具有較好的密封性。在盒子的對(duì)立側(cè)上下鉆孔，用硅膠將輸液皮條管道與孔連接緊密，把實(shí)驗(yàn)組的6孔板放進(jìn)奶粉盒內(nèi)，覆蓋一層保鮮膜，扣上蓋子，蓋子與盒身四周處涂抹蜂蠟，待干。一側(cè)管道充入94%N2、5%CO2、1%O2混合氣體，另一側(cè)管道接測(cè)氧儀探測(cè)自制密封盒內(nèi)是否達(dá)到缺氧，當(dāng)測(cè)氧儀指示<1%，關(guān)閉輸液管道調(diào)節(jié)器，再折疊輸液管道用鑷子夾閉，則自制的密封盒處于無(wú)氣體對(duì)流的狀態(tài)即缺氧狀態(tài)。

1.5 觀察及測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡觀察各組的細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目改變。

1.5.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性 HUVECs細(xì)胞分組及培養(yǎng)同前，加入CCK-8試劑，放于原培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度(A值)。

1.5.3 Hoechst 33258法觀察細(xì)胞核形態(tài)變化 HUVECs細(xì)胞分組及培養(yǎng)同前，加入甲醛和冰醋酸1 mL，固定15 min，洗滌，每孔加Hoechest 33258 1 mL，染色5 min后，熒光顯微鏡下觀察。

1.5.4 DCFH-DA對(duì)活性氧(ROS)進(jìn)行染色 HUVECs細(xì)胞分組及培養(yǎng)同前，每個(gè)孔加DCFH-DA混合液1 mL，孵育20 min，洗凈。熒光顯微鏡觀察。

1.5.5 Western blot檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)水平 提取蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、快速封閉、洗膜，滴加缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、β-actin蛋白4℃孵育過(guò)夜，滴加二抗溶液常溫孵育1 h，曝光。

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 Control組細(xì)胞貼壁，呈梭形或橢圓形，細(xì)胞密度高。而實(shí)驗(yàn)組隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，黏附瓶底的細(xì)胞減少，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞間隙增大，鏡下可見細(xì)胞碎片和脫落漂浮的細(xì)胞，見圖1。

A.Control組；B.3 h/2 h組；C.6 h/2 h組；D.9 h/2 h組；E.12 h/2 h組(白色箭頭表示貼壁細(xì)胞，黑色箭頭表示漂浮細(xì)胞)；×40；標(biāo)尺100 μm。

2.2 CCK-8法細(xì)胞活性水平檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，不同H/R時(shí)間組細(xì)胞活性均低于Control組(P<0.05)。9 h/2 h組和12 h/2 h組細(xì)胞活性低于3 h/2 h組和6 h/2 h組(P<0.05)，而6 h/2 h組與3 h/2 h組、12 h/2 h組與9 h/2 h組細(xì)胞活性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞活性

2.3 Hoechst 33258核染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況 Control組HUVECs細(xì)胞核形態(tài)完整，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均一，各實(shí)驗(yàn)組隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞核邊集化、碎裂馬蹄狀逐漸增多，見圖2。

A.Control組；B.3 h/2 h組；C.6 h/2 h組；D.9 h/2 h組；E.12 h/2 h組(白色箭頭表示損傷細(xì)胞核)；×40；標(biāo)尺100 μm。

2.4 ROS含量的變化 A組HUVECs無(wú)綠色熒光，B、C、D和E組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。不同H/R時(shí)間組ROS均低于Control組(P<0.05)。9 h/2 h組和12 h/2 h組ROS低于3 h/2 h組和6 h/2 h組(P<0.05)，而6 h/2 h組與3 h/2 h組、12 h/2 h組與9 h/2 h組ROS比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、表2。

A.Control組；B.3 h/2 h組；C.6 h/2 h組；D.9 h/2 h組；E.12 h/2 h組；×100；標(biāo)尺100 μm。

表2 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞熒光強(qiáng)度

2.5 HIF-1α蛋白表達(dá)水平 不同H/R時(shí)間組HIF-1α蛋白表達(dá)均高于Control組(P<0.05)。9 h/2 h和12 h/2 h組HIF-1α蛋白表達(dá)水平高于3 h/2 h組和6 h/2 h組(P<0.05)，而6 h/2 h組與3 h/2 h組、12 h/2 h組與9 h/2 h組HIF-1α蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、表3。

圖4 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)情況

表3 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α表達(dá)

3 討論

心梗和腦梗是心腦血管系統(tǒng)疾病中常見且嚴(yán)重的疾病[5]，遠(yuǎn)超于其他疾病而高居榜首[6-7]。臨床上最常見的治療方法是使用藥物進(jìn)行溶栓、抗凝，以盡快恢復(fù)血流，但在恢復(fù)血流的同時(shí)也會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的IRI，有可能導(dǎo)致病情的進(jìn)一步惡化[8-9]，產(chǎn)生不可逆損傷。所以，深入了解和研究IRI機(jī)制對(duì)心、腦血管疾病患者康復(fù)具有重要臨床價(jià)值。體外誘導(dǎo)細(xì)胞H/R可作為探究心、腦血管IRI的模型[10]。

目前國(guó)內(nèi)外H/R模型主要有物理方法和化學(xué)方法[11]。最常見的是物理模型三氣箱，但是該儀器昂貴、難普及，有的實(shí)驗(yàn)室雖然具備該儀器，但后期使用時(shí)需要不斷充入氣體，成本投入很大。化學(xué)模型常用的有連二亞硫酸鈉[12]、氯化鈷[13]、氰化物[14]等，這些藥品都是劇毒的，對(duì)細(xì)胞本身有影響，并且對(duì)研究人員身體健康有危害。所以尋求一種簡(jiǎn)易、低成本、易操作、安全的建模方法是非常有意義和必要的。本研究利用奶粉盒、蜂蠟建立密封盒，然后通入94%N2、5%CO2、1%O2混合氣體，測(cè)氧儀測(cè)的氧濃度<1%，即構(gòu)建缺氧環(huán)境。

現(xiàn)有的模型建立沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，主要的衡量水平是引起穩(wěn)定的細(xì)胞損傷，例如細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡率等[15]。缺氧時(shí)間各不同[16-17]，本研究中發(fā)現(xiàn)缺氧12 h以后，細(xì)胞大量變圓，漂浮，易造成較大誤差。所以本研究設(shè)置缺氧時(shí)間組別均在12 h之內(nèi)。

有研究表明ROS機(jī)制是造成H/R損傷的重要標(biāo)志，DCFH-DA被細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS氧化生成DCF，呈現(xiàn)綠色熒光。本研究結(jié)果表明隨著缺氧的延長(zhǎng)，綠色的熒光顯著增加，說(shuō)明自制密封盒法創(chuàng)建的缺氧環(huán)境可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)釋放大量的ROS，模擬體內(nèi)IRI過(guò)程。同時(shí)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁的細(xì)胞減少，CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性降低顯著。研究表明缺氧環(huán)境下，最常見的一種氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子——HIF-1α就會(huì)被激活，能夠使細(xì)胞適應(yīng)短暫的缺氧[18]。一定缺氧時(shí)間范圍內(nèi)，HIF-1α與缺氧時(shí)間呈正比例關(guān)系。值得注意的是，組織缺血造成細(xì)胞損傷包括氧氣的缺乏和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的阻斷，所以氧糖剝奪時(shí)培養(yǎng)液換成無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基，復(fù)氧時(shí)換成完全培養(yǎng)基，這樣才更貼近臨床上IRI狀態(tài)。

本研究結(jié)果證明自制的簡(jiǎn)易密封盒能夠構(gòu)建有效的細(xì)胞H/R模型，為臨床研究IRI的機(jī)制提供輔助作用。