馬妍 劉洋洋 馮劍 黃夢利, 邢益濤 趙明明

（1.海南醫(yī)學院中醫(yī)學院 海南?？?570100；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所/海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室 海南?？?570311；3.海南省中醫(yī)院 海南海口 570203）

蛇足石杉為石杉科石杉屬植物蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Murray) Trev.的干燥全草，始載于《植物名實圖考》[1]，云：“千層塔生山石間，蔓生綠莖，小葉攢生，四面如刺，間有長葉及梢頭葉，俱如出生之柳葉。可煎洗腫毒跌打及鼻孔作癢?！?，又名千層塔、蛇足石松[1-3]；多年生土生植物，葉緣具粗齒，莖高10～30 cm；生態(tài)環(huán)境極其惡劣，存于海拔200～1 400 m的林下或潮濕的溝谷巖石上。我國海南各地及廣東、廣西、四川、貴州、云南等地均有種植[4]。蛇足石杉味苦、辛、微甘，性平；歸肺、大腸、肝、腎經(jīng)；有小毒，具有散瘀止血、消腫止痛、清熱解毒的功效，用于跌打損傷、勞傷吐血、尿血、痔瘡下血、瘀血腫痛、肺炎[5]。海南地區(qū)蛇足石杉多用于治療跌打損傷、蟲蛇叮咬、燒燙傷等。蛇足石杉含有多種化合物并具有較高的臨床藥用價值，如全草含蛇足石松堿（lycoserrine）、千層塔堿（serratine）、石松堿（lycopodine）、石松文堿（lycoclavine）、石杉堿（huperzine）等生物堿，千層塔烯二醇（ serratenediol ）、千層塔烯二醇-3-乙酸酯（serratenediol-3-acetate）、千層塔烯四醇（tohogeninol）等三萜類化合物[6]。蛇足石杉水煎劑醇沉液能明顯抑制小鼠的自發(fā)活動，具有抑制中樞作用[7]；石杉堿甲具有很強的可逆性抗膽堿酯酶作用，亦對記憶鞏固、記憶再現(xiàn)效應有增強作用[8]。此外，石松堿、石松文堿對家兔和豚鼠有縮瞳作用，對福氏痢疾桿菌、宋氏痢疾桿、志賀痢疾桿菌具有敏感性，可用于治療腹瀉及痢疾等[9]。

目前蛇足石杉的研究主要集中于其藥用價值、化學成分、資源分布、傳統(tǒng)栽培技術等方面[10-16]。《中國藥典》及地方藥材關于蛇足石杉藥材標準尚未收錄。因此，為明確蛇足石杉藥材質(zhì)量控制標準，彌補蛇足石杉藥材記載的空缺，對海南地方習用藥材蛇足石杉的質(zhì)量標準進行研究，為蛇足石杉藥材的市場流通、臨床應用及深度開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑儀器：CLPSE 80i生物顯微鏡（日本尼康株式會社）、UV2450紫外可見分光光度計（日本島津制作所）、SX-G021-3馬弗爐（天津中環(huán)電爐股份有限公司）。試劑：無水乙醇、FAA固定液、二甲苯、中性樹膠、磷酸二氫鉀、戊二醛（均為國產(chǎn)分析純）。

1.1.2 試材本實驗用的 10批次蛇足石杉藥材樣品分別采自海南省五指山市、瓊中黎族苗族自治縣、白沙黎族自治縣、昌江黎族自治縣、陵水黎族自治縣等地，均為野生種，詳細信息見表1。

其中，蛇足石杉對照藥材（批號SZ20180302QZ07）于2018年3月采于海南省瓊中黎族苗族自治縣黎母山，除去雜質(zhì)，曬干而得。原植物經(jīng)廣東藥科大學鄭希龍副研究員鑒定為石杉科（Huperziaceae）石杉屬（Huperzia Bernh.）植物蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Murray)Trev.，憑證（臘葉）標本保存于海南省中藥標本館（?？谑兴幑人穆?號中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所），蛇足石杉基原植物和藥材見圖1。

圖1 蛇足石杉基原植物及藥材

1.2 方法

1.2.1 性狀檢定參照《中國藥典》[5]2020年版四部和《國家藥品標準工作手冊》[17]的性狀檢定方法，對10批蛇足石杉藥材的性狀特征、表面色澤、質(zhì)地及氣味進行檢定和描述。

1.2.2 鑒別

1.2.2.1 顯微鑒別參照《中國藥典》[5]2020年版四部和《國家藥品標準工作手冊》[17]的顯微鑒別法，將10批蛇足石杉藥材粉碎，過四號篩；挑取少許粉末置載玻片上，滴加水合氯醛試液進行透化，加蓋玻片，于生物顯微鏡下觀察蛇足石杉藥材粉末的顯微結構特征。

1.2.2.2 展開劑的考察為篩選合適的展開試劑，分別選擇石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7∶7∶1∶0.035）（A）、石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（6∶6∶0.1∶0.15）（B）、三氯甲烷-甲醇-石油醚(60～90℃)-乙酸（5∶0.5∶10∶0.05）（C）、石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（10∶5∶0.5∶0.05）（D）、石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8∶4∶0.5∶0.1）（E）作為展開劑，顯色后進行對比。通過試驗考察，最終選用石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7.5∶7.5∶1∶0.035）為展開劑，結果顯示，其薄層色譜的斑點集中、Rf值適中，可用于蛇足石杉的薄層鑒別研究，結果見圖2。

圖2 不同展開劑下薄層色譜圖

1.2.2.3 薄層鑒別將蛇足石杉樣品粉碎，過四號篩后取 1 g，加 95%乙醇 15 mL，超聲處理30 min，濾過，濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取蛇足石杉對照藥材粉末 1 g，同法制成對照藥材溶液。參照《中國藥典》[5]2020版四部通則0502薄層色譜法進行試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各15 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7.5∶7.5∶1∶0.035）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰后，置日光下直接檢視。

1.2.3 水分、總灰分、浸出物的測定蛇足石杉藥材的水分參照《中國藥典》[5]2020年版四部通則0832項的烘干法進行測定；總灰分參照《中國藥典》[5]2020年版四部通則2302項的總灰分測定法進行測定；浸出物參照《中國藥典》[5]2020年版四部通則2201項下醇溶性浸出物熱浸法進行測定。

2 結果與分析

2.1 蛇足石杉性狀

蛇足石杉根為須狀，黃白色。莖多斷裂，不分枝或多回二歧分枝。質(zhì)脆易折斷，斷面蜂窩狀。不育葉螺旋狀排列，有短柄或近無柄，披針形，長1～2.3 cm，寬2～5 mm，先端漸尖，基部楔形，邊緣有不整齊的尖鋸齒，主脈明顯，葉紙質(zhì)（圖3）。能育葉與不育葉同形，孢子囊生于孢子葉的葉腋。氣微，味淡。

圖3 蛇足石杉葉形（葉緣具粗齒）

2.2 鑒別

2.2.1 蛇足石杉顯微鑒別蛇足石杉粉末呈棕褐色（圖4）；表皮細胞垂周壁波狀或深波狀彎曲，氣孔不定式。導管少見，多為螺紋導管。孢子囊腎形，孢子囊環(huán)帶偶見細胞。

圖4 蛇足石杉粉末顯微鑒別

蛇足石杉莖橫切面（圖5）：外側可見鱗葉殘基，表皮細胞1～4列，內(nèi)側具厚壁細胞數(shù)列；皮層寬廣，維管束散在；內(nèi)皮層窄，原生中柱為星芒狀，木質(zhì)部與韌皮部為外始式，呈4～8個輻射排列脊狀突起，星芒脊狀突起部分呈倒三角形，髓部?。▓D6）。

圖5 蛇足石杉藥材莖橫切面

圖6 蛇足石杉中柱放大

2.2.2 薄層鑒別將顯色后的薄層板置于日光燈下直接檢視，其余9批蛇足石杉供試品的薄層色譜中，在與蛇足石杉對照藥材色譜相應的位置上，均顯示相同顏色的斑點，如圖7。

圖7 十批蛇足石杉藥材的薄層色譜圖

2.3 水分、總灰分、浸出物的測定

十批蛇足石杉樣品的水分、總灰分、浸出物測定結果見表2。10批蛇足石杉的水分平均值為9.50%，其中采自陵水吊羅山蛇足石杉水分最高（9.82%），采自昌江霸王嶺東五區(qū)的水分最低（9.25%）。10批蛇足石杉的總灰分平均值為6.18%，其中采自昌江霸王嶺東五區(qū)的蛇足石杉總灰分最高（9.08%），采自白沙南開鄉(xiāng)的總灰分最低（4.54%）。10批蛇足石杉的醇溶性浸出物平均值為14.20%，其中采自昌江霸王嶺東五區(qū)的蛇足石杉醇溶性浸出物最高（15.79%），采自白沙鸚哥嶺的最低（12.05%）。

表2 十批蛇足石杉藥材的水分、總灰分及浸出物值(n=3)

3 討論與結論

3.1 蛇足石杉藥材的水分、總灰分及浸出物檢查項限值的確定

10批蛇足石杉藥材的水分為9.25%～9.82%，將 10批蛇足石杉的水分平均值乘以 120%得11.39%。因此，擬規(guī)定蛇足石杉藥材的水分不得超過 12.0%。10批蛇足石杉藥材的總灰分為 4.54%～9.08%，將10批蛇足石杉的總灰分平均值乘以120%得7.41%。因此，擬規(guī)定蛇足石杉藥材的總灰分不得超過 7.5%。10批蛇足石杉藥材的醇溶性浸出物為 12.05%～15.79%，將 10批蛇足石杉藥材的浸出物平均值乘以80%得11.36%。因此，擬規(guī)定蛇足石杉藥材的醇溶性浸出物不得少于11.0%。

3.2 蛇足石杉指標成分的含量測定

石杉堿甲（Hup A）對膽堿酯酶具有選擇性的抑制作用，并且能夠通過血-腦屏障促進記憶再現(xiàn)和增強記憶保持，主要用于治療重癥肌無力和老年癡呆[18]，是蛇足石杉的重要活性成分[18-19]。但蛇足石杉中所含Hup A含量過低，如袁經(jīng)權等[20]所測12批不同產(chǎn)地的蛇足石杉樣品中，根、葉、莖中石杉堿甲含量最高的廣西大容山蛇足石杉，僅分別為0.090 0%、0.031 7%、0.033 2%；王俊等[21]采用高效液相色譜法測得蛇足石杉中Hup A含量為0.022 6%，是23種可提取Hup A的原植物中含量較低的；杜次等[22]檢測結果顯示，湘西蛇足石杉中的Hup A含量更低，僅為0.518%；李關艷等[23]采用LC-MS法測定溫室大棚種植的蛇足石杉莖葉所含Hup A，結果顯示，莖中Hup A含量為0.044 4%，葉中為0.055 9%；顧月華等[24]測定結果顯示，蛇足石杉Hup A含量為0.011 8%。本研究測定的10批蛇足石杉中，Hup A含量皆小于0.03%，且方法復雜，穩(wěn)定性低，專屬性不強，故蛇足石杉中石杉堿甲含量暫不錄入標準研究。

本研究對海南地方習用藥材蛇足石杉藥材的性狀、顯微特征結構、薄層色譜、水分、總灰分、醇溶性浸出物等質(zhì)量指標進行研究，并規(guī)定其質(zhì)量標準，對確保海南地方習用藥材蛇足石杉的市場流通、臨床用藥安全及其作為制劑原料的安全性、有效性和穩(wěn)定性均具有一定的意義。