麥宗炯，蔡玉瑩，王美才，楊志雄，吳愛兵

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，廣東 湛江 524000；2.湛江中心人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 湛江 524000

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，中國每年新增肺癌患者約30 萬例[1]。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)兩大類，非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌病例的85%以上[1-2]。肺癌早期往往無明顯癥狀，超過一半的肺癌患者在確診時伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者的5 年總生存率還不到5%[3-4]。非小細(xì)胞肺癌的高發(fā)病率與高致死率使其成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因。因此，研究和開發(fā)新的方法對非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療具有重要意義。

許多研究表明miRNAs/miRs 參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[5]。miRNAs 是一類由17～25 個核苷酸組成的高度保守的單鏈非編碼RNA，其通過與靶信使RNA(mRNA)的3'-非翻譯區(qū)(3'UTR)相互作用來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，被廣泛認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子[6]。已有研究報道，miRNAs 通過參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移在多種類型的人類腫瘤中作為促癌因子或抑癌因子[7]。在非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)進(jìn)展中，也發(fā)現(xiàn)了一些重要的miRNA 與非小細(xì)胞肺癌患者的生存和癌癥復(fù)發(fā)密切相關(guān)[8]。miR-28由染色質(zhì)3q27-28 轉(zhuǎn)錄而來，其前體(pre-miR-28)在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過Dicer 酶加工后生成成熟體miR-28-3p和miR-28-5p[9]。miR-28 已被證實在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常。miR-28 在腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性，具有腫瘤促進(jìn)或腫瘤抑制的作用。研究表明miR-28 在胃癌[10]、卵巢癌[11]中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而在非霍奇金淋巴瘤[12]、肝癌[13]中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。目前關(guān)于miR-28 的表達(dá)異常在非小細(xì)胞肺癌的作用尚不明確[14]。因此，miR-28 在調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用機制方面需要進(jìn)一步研究，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 miR-28 minics 和miR-28 inhibitor轉(zhuǎn)染序列購買于上海吉瑪公司(hsa-miR-28-5p mimics：sense 5'-AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG-3'，antisense 5'-CAAUAGACUGUGAGCUCCUUUU-3'，mi-m-ics NC：sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；anti-sense 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；hsamiR-28-5p inhibitor：5'-CUCAAUAGACUGUGA-GCU CCUU-3'，inhibitor NC：5'-CAGUACUUUUGUGUAG-UACAA-3')。Transwell 小室和基質(zhì)膠來自Corning公司，熒光素酶報告基因試劑來自美國ABcom 公司，細(xì)胞周期試劑來自碧云天公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、RPMI1640為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，胎牛血清、蛋白裂解液、PVDF 膜購自華奇盛公司，RAP1B抗體購于Cell Signaling Technology 公司，二抗購于中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法 人肺腺癌細(xì)胞株A549 和H299為貼壁細(xì)胞，為廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床科研中心保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時用于實驗。

1.3 CCK8 實驗 取生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)細(xì)胞，在96孔板中加入100 μL的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37°C，5%CO2)，向培養(yǎng)板中加入10 μL不同濃度的待測物質(zhì)。將培養(yǎng)板在孵育箱內(nèi)孵育24 h。向每孔加入10 μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在孵育箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 波長測定各孔吸光度值(OD 值)，以相對應(yīng)OD 比值表示細(xì)胞增殖能力大小。實驗重復(fù)3次，以時間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 平板克隆實驗 取生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)細(xì)胞，接種100個細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)箱中孵育兩周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次后，加入甲醇固定15 min。去甲醇后空氣干燥；用Giemsa應(yīng)用染液染色5 min。流水緩慢洗去染液，空氣干燥后用肉眼直接計數(shù)克隆。實驗重復(fù)3 次。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)100%。

1.5 細(xì)胞周期實驗 生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上，RPMI 1640 培養(yǎng)基中直徑為10 cm 的培養(yǎng)板含有10%的人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞(NBC)。孵育24 h 后，總共收集1×106個細(xì)胞，用冷PBS 沖洗，并在4℃下用70%冰冷乙醇固定48 h。用冷PBS 沖洗固定細(xì)胞，然后與含有10 μg/mL 碘化丙啶的PBS 孵育以及0.5 mg/mL RNA酶A，在37℃下持續(xù)15 min。DNA使用流式細(xì)胞儀獲取標(biāo)記細(xì)胞的含量。每次實驗分3次進(jìn)行。

1.6 劃痕實驗 將對數(shù)生長期細(xì)胞(1×l05個/孔)分別單層接種至6 孔板中，待融合度達(dá)50%～60%時，棄去培養(yǎng)基，用l mL 藍(lán)色槍尖劃痕，PBS 洗細(xì)胞三次后加入含有10%胎牛血清(FBS)的新鮮培養(yǎng)基，開始實驗時間記錄為W0h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h(W24h)，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。采用愈合率為細(xì)胞遷移能力的量化評估標(biāo)準(zhǔn)，愈合率=(W0h-W24h)/W0h×l00%。實驗重復(fù)3次。

1.7 Transwell小室遷移實驗 生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次后，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。加100 μL細(xì)胞懸液于內(nèi)室，然后加500 μL含10%新生牛血清的完全培養(yǎng)基于下室，37℃培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過膜的細(xì)胞，甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥，用Giemsa應(yīng)用染液染色5 min，用蒸餾水輕輕地沖洗數(shù)次，空氣中風(fēng)干。顯微鏡下隨機選取5個高倍視野計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次。

1.8 Boyden小室侵襲實驗 利用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠(Matrigel)(按1∶8稀釋)，在Chamber上室底部中央垂直加入100 μL 稀釋后的Matrigel，37℃溫育4 h 使其干成膠狀，取對數(shù)生長期細(xì)胞、胰酶消化、加培養(yǎng)基終止消化，離心2 min(800 r/min)，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞加100 μL無血清細(xì)胞懸液于小內(nèi)室，在24 孔板下室加入500 μL 含20%FBS 的培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)箱孵育16 h。收集小室，利用棉簽擦拭小室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定＞5 min，PBS 液清洗3 次，空氣風(fēng)干。400倍顯微鏡下隨機五個視野觀察細(xì)胞并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6 孔板中，將野生型(RAP1B-WT)或突變型(RAP1B-mut)報告質(zhì)粒與miR-28 或miR-control 共轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h 后嚴(yán)格按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.10 實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 收集處于對數(shù)生長期的肺腺癌細(xì)胞，PBS 洗兩遍，加入Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT PCR檢測。miR-28 mimics引物序列為：5'-ACACTCCAGCTGGGAAGGAGCTCACAGTC-3'(上游序列)，5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (下游序列)；內(nèi)參U6 的引物序列為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3' (上游序列)，5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3' (下游序列)。每孔10 μL體系，設(shè)置3個平行樣。樣本經(jīng)過3 次獨立重復(fù)實驗，所得數(shù)據(jù)使用2-ΔCt或者2-ΔΔCt(ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參)進(jìn)行相對定量分析。

1.11 Western blot 取狀態(tài)良好對數(shù)生長期細(xì)胞，提取蛋白，配制10%SDS聚丙烯酰胺凝膠，并加入30 μg蛋白進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF上。3%牛血清白蛋白封閉后，加入RAP1B 抗體和β-Actin抗體進(jìn)行孵育。然后用二抗進(jìn)行孵育，用奧德賽條帶掃描儀掃描蛋白條帶。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組計量資料比較采用非配對t檢驗，而兩組以上計量資料比較采用方差分析(ANOVA)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 驗證轉(zhuǎn)染效率 為了研究miR-28在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中潛在的生物學(xué)功能，把miR-28 mimics、miR-28 NC、miR-28 inhibitor分別轉(zhuǎn)染到A549 和H1299 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中。RTq-PCR結(jié)果顯示：與miR-28 NC比較，轉(zhuǎn)染miR-28 mimics后肺癌細(xì)胞miR-28 的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染miR-28 inhibitor 后肺癌細(xì)胞miR-28 的表達(dá)下降，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 RTq-PCR結(jié)果驗證轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞miR-28表達(dá)水平

2.2 miR-28對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響 在確定轉(zhuǎn)染成功后，通過CCK-8、克隆形成實驗和細(xì)胞周期實驗評估非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299細(xì)胞的增殖能力。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與miR-28 NC比較，轉(zhuǎn)染miR-28 mimics組A549 和H1299 細(xì)胞的增殖速度均明顯減慢；轉(zhuǎn)染miR-28 inhibitor 組A549 和H1299 細(xì)胞的增殖速度則增快(圖2A、2B)。克隆形成實驗結(jié)果顯示，與miR-28 NC 比較，轉(zhuǎn)染miR-28 mimics 組A549 和H1299 細(xì)胞的克隆形成率均明顯減 少：A549：(106.33±18.58) vs (46±8.00)；H1299：(87.67±6.43)vs(38.67±3.51)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染miR-28 inhibitor 組的克隆形成率則明顯增加：A549：(90.33±8.15)vs(130±5.29)；H1299：(93.67±7.77) vs (121±12.53)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。CCK-8 實驗、克隆形成試驗結(jié)果直接表明，過表達(dá)miR-28可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，抑制miR-28表達(dá)則促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-28 使處于S期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的百分比下降，瞬轉(zhuǎn)miR-28 inhibitor 與miR-28 NC 處于S 期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的百分比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2E)。

圖2 miR-28抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖

2.3 miR-28 抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲 利用劃痕實驗、Transwell 遷移實驗和Boyden 侵襲實驗探究miR-28 對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響。在劃痕實驗中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-28后A549 和H1299 細(xì)胞的遷移能力均下降，而沉默miR-28的表達(dá)后A549和H1299細(xì)胞的遷移能力均增加(圖3)。

圖3 miR-28抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲

2.4 miR-28直接靶向RAP1B 作為RAS癌基因家族的一員，RAP1B被發(fā)現(xiàn)參與人類癌癥的調(diào)控。通過生物信息學(xué)(TargetScan、PicTar)等軟件分析發(fā)現(xiàn)RAP1B可能是miR-28的潛在靶基因，兩者的結(jié)合位點如圖4所示。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-28可以直接靶向RAP1B。將野生型(RAP1B-WT)或突變型(RAP1B-mut)報告質(zhì)粒與miR-28或miR-control共轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中，結(jié)果顯示在miR-28 mimic 和RAP1B-WT共轉(zhuǎn)染組中，熒光素酶活性顯著降低；而在miR-28 mimic和RAP1B-mut共轉(zhuǎn)染組中，熒光素酶活性并未降低(圖5)。這些證據(jù)表明在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中RAP1B是miR-28的作用靶點。

圖4 miR-28可靶向結(jié)合RAP1B的3’-UTR 區(qū)的同源序列

圖5 熒光素酶活性檢測實驗結(jié)果顯示miR-28直接靶向RAP1B

2.5 miR-28 在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制RAP1B 基因的表達(dá) 利用RT-qPCR 和Western blot 方法檢測miR-28 分別在mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平調(diào)節(jié)RAP1B 表達(dá)的作用。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與miR-28 NC 比較，miR-28 mimics 轉(zhuǎn)染后的A549 和H1299 細(xì)胞內(nèi)源性RAP1B mRNA水平顯著降低；miR-28 inhibitor 轉(zhuǎn)染后的A549 和H1299 細(xì)胞內(nèi)源性RAP1B mRNA 水平則顯著增加(圖6A、6B)。利用Western blot 方法檢測A549 和H1299 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-28 mimics、miR-28 inhibitor后RAP1B蛋白水平的變化情況，結(jié)果顯示miR-28 過表達(dá)顯著抑制RAP1B 的蛋白表達(dá)水平，抑制miR-28 則提高RAP1B 的蛋白表達(dá)水平(圖6C、6D)。

圖6 miR-28在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平抑制RAP1B的表達(dá)

3 討論

miRNAs 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療預(yù)后的評估中起著重要的作用[15]。miR-28 作為一種可能調(diào)節(jié)腫瘤生長的miRNA，其表達(dá)水平與癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲密切相關(guān)。筆者對既往的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧學(xué)習(xí)，發(fā)現(xiàn)miR-28 在胃癌[10]中表達(dá)升高促進(jìn)癌癥進(jìn)展，而在非霍奇金淋巴瘤[12]中上調(diào)則抑制腫瘤進(jìn)展；miR-28 不同的亞型在同類細(xì)胞的作用也不一致，在鼻咽癌細(xì)胞[16]中發(fā)現(xiàn)miR-28-5p 可抑制細(xì)胞增殖、侵襲，而miR-28-3p 促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲。上述研究說明miR-28 在不同類型癌癥中的作用并不總是相同的，而miR-28 的不同亞型在同一種癌癥中可能具有完全相反的功能。

目前研究認(rèn)為RAP1B 可以通過與GTP 結(jié)合產(chǎn)生活性形式而與大量效應(yīng)蛋白結(jié)合，從而將信號傳輸?shù)叫盘柾返南掠谓M件，產(chǎn)生細(xì)胞調(diào)控作用[17]。既往的許多研究表明RAP1B 在多種癌癥中存在顯著的調(diào)節(jié)作用，其通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和參與多種免疫細(xì)胞的功能來影響腫瘤進(jìn)展。研究表明負(fù)調(diào)控RAP1B 的表達(dá)能抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展[18-19]，抑制甲狀腺癌中RAP1B 的表達(dá)同樣可以抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲[20]，而RAP1B的過表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)[21]。為了探究miR-28 抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用機制，筆者通過miRNA生物信息學(xué)分析和熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)miR-28與RAP1B基因有較高的匹配度，并通過熒光素酶報告實驗證明RAP1B 是miR-28 調(diào)控的一個下游靶基因。實驗結(jié)果表明在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-28可以抑制RAP1B基因的表達(dá)，而下調(diào)miR-28 則會促進(jìn)RAP1B 基因的表達(dá)。這表明miR-28在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平上均抑制內(nèi)源性RAP1B的表達(dá)，這在一定程度上解釋了miR-28抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生。

綜上所述，miR-28 過表達(dá)時可通過下調(diào)RAP1B基因的表達(dá)來抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲。