李佩佩 王永霞 徐珊珊 周冰燚 李銘臻

廣東省生殖科學(xué)研究所//廣東省生殖醫(yī)院//國家衛(wèi)生健康委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東廣州 510600

不孕不育已經(jīng)成為一個(gè)世界性生殖健康問題，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約有20%～25%的育齡期的夫婦受此困擾, 其中男性因素約占其中的50%，而無精子癥是導(dǎo)致男性不育最常見的病因[1]。如何準(zhǔn)確地評價(jià)無精子癥患者睪丸的生精功能是治療的前提。睪丸活檢可對無精子癥患者睪丸的生精功能狀態(tài)和生精障礙程度進(jìn)行直接評價(jià)分析，對于男性不育癥的病因、分類、診斷、治療和預(yù)后評估都具有很重要的意義，也是研究男性不育癥的重要方法。但是現(xiàn)階段評價(jià)睪丸生精功能的標(biāo)準(zhǔn)不一，對臨床指導(dǎo)性不足。本研究通過對348例無精子癥患者睪丸活檢的病理資料進(jìn)行回顧性分析，觀察其睪丸組織病理學(xué)改變及生精功能狀態(tài)，對其生精功能進(jìn)行詳盡的病理分型，并分析其臨床意義及其對男性不育癥診斷治療的指導(dǎo)價(jià)值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2019年12月在廣東省生殖醫(yī)院就診的無精子癥患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①無精子癥，至少進(jìn)行3次常規(guī)精液化驗(yàn)并離心沉淀后顯微鏡下檢查均未找到精子；②內(nèi)分泌檢查未見異常；③雙側(cè)睪丸大小、質(zhì)地未見明確異常；④無腫瘤、隱睪病史；⑤患者行睪丸穿刺活檢病理檢查。本組共348例，年齡23～49歲，平均年齡32.4歲。

1.2 方法

睪丸穿刺組織取出后，立即放入Bouin氏液固定，組織脫水、浸蠟，包埋, 制成蠟塊后，切成3 μm的石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。鏡下觀察：①曲細(xì)精管的數(shù)量、形狀、管徑的大小、基底膜厚度，曲細(xì)精管與間質(zhì)的比例；②各級生精細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、排列分布及各級生精細(xì)胞之間的比例，成熟精子的數(shù)量；③支持細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)、分布；④間質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量、分布、形態(tài)。

2 結(jié)果

無精子癥睪丸病理活檢組織，取材滿意為鏡下曲細(xì)精管橫斷面數(shù)量≥30 個(gè)，入組病例全部取材滿意。根據(jù)其主要組織病理學(xué)特征及有無成熟精子，無精子癥睪丸活檢可分為2種類型：梗阻性無精子癥(obstructed azoospermia,OA)和非梗阻性無精子癥(non-obstructed azoospermia,NOA)。

2.1 梗阻性無精子癥(OA)

梗阻性無精子癥166例，占47.70%，病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)主要是曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞形態(tài)及各級生精細(xì)胞的比例基本正常，曲細(xì)精管內(nèi)可見成熟精子，基底膜厚度、間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及分布基本正常。根據(jù)曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞和成熟精子的數(shù)量不同，可進(jìn)一步分為生精功能基本正常，平均每個(gè)曲細(xì)精管橫斷面成熟精子數(shù)量≥20 個(gè)；輕度生精功能低下，平均每個(gè)曲細(xì)精管橫斷面成熟精子數(shù)量≥10 個(gè)且<20 個(gè)；中度生精功能低下，平均每個(gè)曲細(xì)精管橫斷面成熟精子數(shù)量≥5個(gè)且<10 個(gè)；重度生精功能低下，平均每個(gè)曲細(xì)精管橫斷面成熟精子數(shù)量<5個(gè)，見表1、圖1。

表1 166例梗阻性無精子癥(OA)病理分級

注：A，生精功能大致正常：曲細(xì)精管管腔大小正常，生精細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、比例基本正常，成熟精子數(shù)量平均≥20個(gè)/管；B，輕度生精功能低下：曲細(xì)精管管腔大小基本正常，生精細(xì)胞形態(tài)、比例基本正常，數(shù)量略減少，成熟精子數(shù)量平均≥10個(gè)/管，但是<20個(gè)/管；C，中度生精功能低下：生精細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)減少，精子細(xì)胞和成熟精子數(shù)量也明顯減少，成熟精子數(shù)量5≥個(gè)/管，但是<10個(gè)/管；D，重度生精功能低下：生精細(xì)胞數(shù)量重度減少，成熟精子數(shù)量<5個(gè)/管

2.2 非梗阻性無精子癥(NOA)

非梗阻性無精子癥182例，占52.30%，根據(jù)生精細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)特征，可以進(jìn)一步分為精子成熟阻滯、唯支持細(xì)胞綜合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)、生精小管透明變性，見表2、圖2。

2.2.1 精子成熟阻滯 有92例，病理特征為曲細(xì)精管管腔大小及其分布大致正常，但曲細(xì)精管內(nèi)生精上皮層次減少，生精細(xì)胞數(shù)量減少或者正常，生精細(xì)胞發(fā)育停滯在精子發(fā)育的某一階段，沒有發(fā)育完全成熟的精子。根據(jù)其精子發(fā)育過程中細(xì)胞停滯在不同的階段，可以分為精原細(xì)胞階段5例(5.43%)、精母細(xì)胞階段38例(41.30%)和精子細(xì)胞階段49例(53.26%)。

2.2.2 唯支持細(xì)胞綜合癥 有77例，其病理學(xué)改變是曲細(xì)精管萎縮、纖維化，管徑不同程度減小，部分管腔閉塞。管腔內(nèi)未見生精細(xì)胞，只余支持細(xì)胞，大部分病例曲細(xì)精管基底膜彌漫增厚、玻璃樣變性。支持細(xì)胞不同程度的增生。少部分病例可見間質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞增生。

2.2.3 生精小管透明變性 有13例，其組織病理學(xué)特點(diǎn)是曲細(xì)精管萎縮、纖維化，管徑縮小閉塞，基底膜增厚玻璃樣變性，管腔內(nèi)未見殘留細(xì)胞，部分病例間質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞增生。

表2 182例非梗阻性無精子癥(NOA)病理分型

注：A，精子成熟阻滯(精母細(xì)胞階段):曲細(xì)精管管腔大小和形態(tài)基本正常，生精上皮層次減少，生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，生精細(xì)胞發(fā)育阻滯在精母細(xì)胞階段，未見精子細(xì)胞及成熟精子；B，精子成熟阻滯(精子細(xì)胞階段)：生精細(xì)胞數(shù)量減少，生精細(xì)胞發(fā)育阻滯在精子細(xì)胞階段，可見較多精子細(xì)胞，但是未見明確成熟精子；C，唯支持細(xì)胞綜合癥：曲細(xì)精管管腔縮小或正常，管腔內(nèi)未見生精細(xì)胞殘留，僅余支持細(xì)胞；D，生精小管透明變性：曲細(xì)精管萎縮、纖維化，管徑縮小閉塞，基底膜增厚玻璃樣變性，管腔內(nèi)未見殘留細(xì)胞，間質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞增生

3 討論

睪丸穿刺病理活檢可以直接評價(jià)無精子癥患者睪丸的生精功能，明確生精功能障礙的類型及病變程度，是無精子癥患者的重要檢查手段之一，為無精子癥患者診療措施的選擇和預(yù)后判斷提供直接的依據(jù)[2]。隨著輔助生育技術(shù)的發(fā)展，卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的誕生及推廣應(yīng)用，對無精子癥患者睪丸生精功能的病理學(xué)評價(jià)分析就越發(fā)重要。

本研究分析的348例無精子癥病例中OA有166例，占無精子癥病例的47.70%。OA根據(jù)其睪丸生精功能以及曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞和成熟精子的數(shù)量，可進(jìn)一步分為生精功能大致正常、輕度生精功能低下、中度生精功能低下和重度生精功能低下。其中生精功能大致正常的病例并不多見，多數(shù)是由于后段輸精管道阻塞引起的，此種患者睪丸體積大致正常，通過睪丸取精術(shù)或附睪取精術(shù)可以達(dá)到生育下一代的目的。經(jīng)直腸超聲可以確定OA的梗阻部位，能夠顯著增加取精的成功率[3]，具有重要的臨床價(jià)值。不同程度的生精功能低下，與睪丸取精的成功率密切相關(guān)，所以區(qū)分出睪丸生精功能的不同程度，對臨床具有指導(dǎo)性意義。有文獻(xiàn)將生精功能低下與輸精管道梗阻分別列為不同類型無精子癥[4]，其實(shí)嚴(yán)格意義來講，生精功能低下的無精子癥也是存在輸精管道梗阻，才導(dǎo)致精子輸出障礙，本文將其統(tǒng)一列為OA。OA必須觀察到成熟精子的存在，部分病例即使見大量精子細(xì)胞，而沒有“梭形頭”的成熟精子，也應(yīng)該歸入精子不完全性成熟阻滯或者精子成熟阻滯于精子細(xì)胞階段。OA曾是難以攻克的男性不育癥難題，隨著睪丸取精術(shù)(testicular sperm extraction,TESE)外科獲取精子技術(shù)和ICSI的誕生與臨床應(yīng)用，其治療也取得重大進(jìn)展[5-6]。ICSI應(yīng)用于梗阻性無精子癥患者睪丸取精術(shù)或附睪取精術(shù)后，取得了較好的效果[7]。目前梗阻性無精子癥的診療取得了很多重大的突破性進(jìn)展，大多數(shù)OA患者能夠擁有自己的后代。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，對于行輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)治療的OA患者，梗阻的病因、精子獲取的方法對于ICSI結(jié)局并沒有明顯相關(guān)性[8-9]。TESE的成功率與生精功能低下的程度密切相關(guān)。睪丸中成熟精子的數(shù)量越多，生精功能越好，睪丸取精的成功率越高。輕-中度的生精功能低下，取精成功率較高，而重度生精功能低下，取精成功率較低。因此，睪丸生精功能的評價(jià)就顯得十分重要，但是生精功能低下與精液細(xì)胞學(xué)、精子形態(tài)、活力相關(guān)性不明。

本研究納入的NOA有182例，占52.30%。根據(jù)生精細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)特征，可以進(jìn)一步分為精子成熟阻滯、SCOS和生精小管透明變性。其中根據(jù)生精細(xì)胞發(fā)育過程阻滯的不同階段，可以細(xì)分為精原細(xì)胞階段、精母細(xì)胞階段和精子細(xì)胞階段。本研究統(tǒng)計(jì)的結(jié)果中精子成熟阻滯于精子細(xì)胞階段病例較多，多伴有不成熟的精子或精子細(xì)胞，又稱之為不完全性成熟阻滯，在病理形態(tài)學(xué)層面上，不完全性的成熟阻滯與重度精子發(fā)生低下需要仔細(xì)鑒別，鑒別要點(diǎn)是否可見成熟精子。1995年，F(xiàn)ishel等[10]與Tesarik等[11]分別用精子成熟阻滯的患者長形及圓形精子細(xì)胞行卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)顯微注射，都獲得成功，說明不成熟的生精細(xì)胞也可以使卵子受精并發(fā)育成胚胎，從而實(shí)現(xiàn)生育的目的，使得對精子成熟阻滯在精子細(xì)胞階段的無精子癥的治療出現(xiàn)了突破性的進(jìn)展[12]。精準(zhǔn)的對無精子癥患者的睪丸生精功能狀況進(jìn)行病理學(xué)評價(jià)分析，為臨床醫(yī)生提供準(zhǔn)確的信息，對治療無精子癥至關(guān)重要。部分精子成熟阻滯在精子細(xì)胞階段的病例被劃分在生精功能低下中，其實(shí)成熟精子的存在才是區(qū)別二者的主要標(biāo)準(zhǔn)，對臨床的診斷和療效有著關(guān)鍵的作用。

SCOS是臨床無精子癥常見的一種病理類型，本研究統(tǒng)計(jì)有77例，病理形態(tài)學(xué)上其曲細(xì)精管基底膜增厚玻璃樣變，管腔內(nèi)僅見支持細(xì)胞增生，未見生精細(xì)胞，臨床常伴有激素水平的變化[13]。在正常情況下，曲細(xì)精管管壁肌樣細(xì)胞收縮，使管腔內(nèi)維持一定的壓力，促使精子向附睪方向輸送，所以，即使在少數(shù)曲細(xì)精管管腔中查見極少數(shù)精子，因?yàn)榛啄げＡ幼儼榧蛹?xì)胞腫脹變性，精液檢查仍表現(xiàn)為無精子癥，提示組織學(xué)上基底膜透明變性會(huì)引起基底膜增厚并導(dǎo)致曲細(xì)精管內(nèi)外部物質(zhì)交換障礙，而支持細(xì)胞功能發(fā)生改變及肌樣細(xì)胞的變性引起的基底膜病變都有可能是導(dǎo)致生精障礙的發(fā)病機(jī)制[14-15]。SCOS的基底膜病變是如何發(fā)生目前尚無定論，有學(xué)者研究提出由垂體功能不足引起的SCOS，可以通過向體外培養(yǎng)系統(tǒng)中加入促性腺激素，可能有助于精子發(fā)育成熟[16],但在體外培養(yǎng)系統(tǒng)去除了基底膜病變所造成的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，因此極少數(shù)SCOS患者從理論上有通過ICSI生育后代的可能。但大多學(xué)者認(rèn)為，以體外培養(yǎng)和使用激素來恢復(fù)生育是不可取的，所以SCOS的治療目前尚有較大爭議[17]。

生精小管透明變性病例少見，本研究統(tǒng)計(jì)有13例，病理形態(tài)學(xué)可見曲細(xì)精管萎縮閉塞、纖維化，基底膜增厚玻璃樣變性，生精細(xì)胞、支持細(xì)胞完全消失，可見殘留少量間質(zhì)細(xì)胞。部分伴明顯間質(zhì)細(xì)胞增生，臨床大多存在染色體異常。不伴有間質(zhì)細(xì)胞增生，多為毒物、射線、藥物或精索靜脈曲張。目前條件下此種類型的無精子癥患者不能獲得自己的遺傳學(xué)后代[18]，只能通過供精達(dá)到生育的目的。但是，生精小管透明變性多與其他類型的生精障礙并存，因此臨床采取多點(diǎn)穿刺取材非常必要，根據(jù)送檢的全部曲細(xì)精管的生精狀態(tài)綜合進(jìn)行判斷，并結(jié)合臨床其他檢查結(jié)果，給出病理診斷。具體情況還應(yīng)結(jié)合臨床其他檢查結(jié)果分析。

綜上所述，睪丸組織中生精細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、基底膜在結(jié)構(gòu)和功能上是密切相關(guān)的一個(gè)整體，它們相互影響，互為因果，因此，無精子癥患者睪丸的病理改變非常復(fù)雜[19]，在同一病例中不同病理病變類型?；旌洗嬖?。本研究所采用的分類方法是根據(jù)其主要的、特征性的病理特點(diǎn)進(jìn)行分型。總之，睪丸活檢組織病理學(xué)評價(jià)作為不育癥男性的重要檢査之一，也是臨床生精功能評價(jià)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，客觀準(zhǔn)確地評價(jià)曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞的數(shù)量、發(fā)育狀態(tài)、精子形態(tài)、精子發(fā)生的階段，進(jìn)而對患者的生殖能力進(jìn)行精確評估，指導(dǎo)臨床選取最優(yōu)的治療方法。但是不同的病理醫(yī)師對睪丸活檢組織中精子發(fā)生發(fā)育狀態(tài)的描述及診斷報(bào)告有差異性，導(dǎo)致了27%的無精子癥患者在選擇治療方法上會(huì)有不同[20]。因此，建立一個(gè)準(zhǔn)確、統(tǒng)一的睪丸活檢組織學(xué)評價(jià)系統(tǒng)，明確各病變亞型的定義，獲得量化參數(shù)，是睪丸活檢病理學(xué)評價(jià)必須解決的難題，尚需進(jìn)一步的探討。