□樊亞琴 楊秀青 于 浩

我國(guó)是世界上最大的食(藥)用菌生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，食用菌年產(chǎn)量超過3,000萬噸。食(藥)用菌被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦為健康保健食品，具有營(yíng)養(yǎng)、健康、安全、美味等特點(diǎn)，同時(shí)還具有極高的藥用價(jià)值[1]。近年來，研究者們相繼從食(藥)用菌中發(fā)現(xiàn)的了具有降血壓、降血脂、抗腫瘤和保肝護(hù)肝等活性的多糖、黃酮、萜烯類等[2～6]，因此，從食(藥)用菌中尋找天然活性天然產(chǎn)物，不僅可以深入探索食(藥)用菌的代謝潛力，更可以服務(wù)于生物醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于食(藥)用菌種質(zhì)資源及其功能活性成分的挖掘，開展從菌物資源到功能分子研發(fā)的前沿領(lǐng)域應(yīng)用基礎(chǔ)研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，制定食(藥)用菌工廠化栽培標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)菌種的規(guī)?；a(chǎn)。此外，還將食(藥)用菌研究應(yīng)用到鄉(xiāng)村振興、東西協(xié)作科技扶貧項(xiàng)目中，在省內(nèi)外示范推廣面積1,300余畝，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值超過4,000余萬元。學(xué)院設(shè)有生物技術(shù)(食用菌)、生物與醫(yī)藥特色專業(yè)，依托山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，以“理論與實(shí)踐結(jié)合、培養(yǎng)能力、鼓勵(lì)創(chuàng)新”為實(shí)踐教學(xué)設(shè)計(jì)與研究的總體目標(biāo)，通過多年的探索實(shí)踐，在微生物(食藥用菌)理論課程學(xué)習(xí)基礎(chǔ)上，開設(shè)食(藥)用菌活性天然產(chǎn)物分離與生物合成實(shí)驗(yàn)、微生物(食藥用菌)實(shí)習(xí)等形式課程，初步形成了以下研究模式。

一、實(shí)踐教學(xué)設(shè)計(jì)

通過食(藥)用菌活性天然產(chǎn)物實(shí)踐教學(xué)(包含領(lǐng)域前沿文獻(xiàn)的檢索、閱讀以及匯報(bào))、微生物(食藥用菌)實(shí)習(xí)，使生物技術(shù)(食用菌)、生物與醫(yī)藥特色專業(yè)學(xué)生在學(xué)習(xí)食(藥)用菌活性物質(zhì)的分離及鑒定的實(shí)驗(yàn)原理與方法的同時(shí)，掌握微生物(食藥用菌)的生產(chǎn)及培養(yǎng)發(fā)酵，為后期從事微生物(食藥用菌)、生物醫(yī)藥等方面的研究、開發(fā)和生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

二、具體實(shí)踐教學(xué)方案

(一)樣品采集。我國(guó)蘊(yùn)含著豐富的食(藥)用菌資源，從中尋找抗菌和抗腫瘤活性化合物具有非常大的潛力。樣品食(藥)用菌資源分為來源于野生食(藥)用菌子實(shí)體(來源于云南省昆明市、山東省煙臺(tái)市、山東省青島市、內(nèi)蒙古赤峰市)和山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資源庫(kù)(目前存有來源于中國(guó)的1,000余株菌種資源庫(kù))菌株。

圖1 長(zhǎng)根菇子實(shí)體 圖2 鹿茸菇菌株

(二)化學(xué)和活性篩選。

1.子實(shí)體化學(xué)篩選。子實(shí)體取50g打磨粉碎，用75%的乙醇回流(95℃,3h)萃取，然后布氏漏斗過濾，將濾液中的乙醇有機(jī)溶液濃縮蒸干，剩余水溶液部分，使用乙酸乙酯萃取三遍后合并，濃縮蒸干得到提取物，采用薄層層析和高效液相進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.菌絲化學(xué)篩選。菌株進(jìn)行不同培養(yǎng)基(馬鈴薯土豆、淀粉等)液體培養(yǎng)基、搖床(28℃,14d)發(fā)酵培養(yǎng)，通過破碎、有機(jī)溶劑萃取、過濾，有機(jī)層濃縮、干燥得到粗提物，采用薄層層析和高效液相進(jìn)行檢測(cè)分析。

3.活性篩選。腫瘤細(xì)胞抑制活性篩選：MTT[7]、CCk-8法[8]測(cè)試樣品對(duì)MCF-7，A549等30株細(xì)胞株的抑制活性。

抑菌活性篩選：以大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis等致病菌為模型，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)樣品進(jìn)行抑菌活性測(cè)試[9]。

采用活性模型篩選(抗腫瘤、抗菌活性模型)方法，篩選得到代謝產(chǎn)物同時(shí)具有化學(xué)多樣性及生物活性的潛力菌株作為研究對(duì)象。

(三)活性物質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。在最佳發(fā)酵條件下對(duì)菌株進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵，獲得粗提物。采用生物活性和現(xiàn)代色譜技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行活性成分的分離，綜合采用快速液相色譜系統(tǒng)、傳統(tǒng)分離手段(硅膠柱、凝膠柱、反相柱層析)并依據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)類型與產(chǎn)量采用多種色譜分離技術(shù)(如PHPLC、Semi-PHPLC等)，減少微量成分的損失，獲得單體化合物。利用多種光譜和波譜解析技術(shù)(UV，IR，MS，1D/2D-NMR等)以及理化特性鑒定單體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用X-ray單晶衍射、化學(xué)溝通和量子化學(xué)計(jì)算等方法確定化合物的絕對(duì)構(gòu)型[10]。

(四)化合物系統(tǒng)活性評(píng)價(jià)。利用活性模型篩選(抗腫瘤、抗菌)模型，對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)，挖掘活性顯著的化合物，為藥物先導(dǎo)化合物提供物質(zhì)儲(chǔ)備。

(五)微生物(食藥用菌)實(shí)習(xí)。篩選得到的菌株進(jìn)行培養(yǎng)、規(guī)模發(fā)酵、試驗(yàn)田的栽培種植實(shí)驗(yàn)。

圖3 白玉菇菌袋出菇 圖4 靈芝土壤種植

三、實(shí)踐教學(xué)特點(diǎn)

(一)特色性。我國(guó)具有豐富的食(藥)用菌資源，大量的食(藥)用菌資源活性天然產(chǎn)物目前尚處于待開發(fā)狀態(tài)。依托青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，開展食(藥)用菌活性天然產(chǎn)物資源開發(fā)和利用，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)菌種的示范種植，對(duì)于充分開發(fā)利用我國(guó)食(藥)用菌資源，促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義，具有很強(qiáng)的產(chǎn)學(xué)研結(jié)合特色。

(二)創(chuàng)新性。采用基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)到綜合實(shí)習(xí)，學(xué)生參與到采種到產(chǎn)出全過程中，不僅學(xué)習(xí)了食(藥)用菌活性天然產(chǎn)物相關(guān)的理論知識(shí)，還充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生的積極性、激發(fā)了他們的主動(dòng)性，打破了僅通過理論課程學(xué)習(xí)的填鴨式教學(xué)，實(shí)現(xiàn)了從課程到實(shí)踐的創(chuàng)新。經(jīng)過實(shí)踐教育，學(xué)生真正實(shí)現(xiàn)了對(duì)課程的深入掌握，在各級(jí)教學(xué)實(shí)踐活動(dòng)中取得了優(yōu)秀的成績(jī)。

(三)前沿性。實(shí)踐教學(xué)同時(shí)還結(jié)合了其他的形式，如學(xué)生以PPT形式匯報(bào)最新研究進(jìn)展，此種方式加強(qiáng)了學(xué)生自主查找文獻(xiàn)的能力；參與學(xué)習(xí)食(藥)用菌專家學(xué)術(shù)講座、山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)會(huì)議以及參與申報(bào)相關(guān)內(nèi)容的大學(xué)生比賽等，讓學(xué)生真正體會(huì)到時(shí)代前沿的食(藥)用菌知識(shí)，對(duì)于我國(guó)的農(nóng)副產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展起到非常重要的作用。

四、結(jié)語(yǔ)

以我國(guó)食(藥)用菌微生物資源為研究對(duì)象，通過教學(xué)實(shí)踐，不僅讓學(xué)生掌握了食(藥)用菌資源的理論知識(shí)，具備對(duì)其活性天然產(chǎn)物的研究能力，同時(shí)還培養(yǎng)了學(xué)生獨(dú)立思考及解決問題的綜合能力，為食(藥)用菌、生物與醫(yī)藥專業(yè)人才的培養(yǎng)提供了重要的參考價(jià)值。