賽睿，張建

石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832003）

高白鮭（Coregonus peled）是鮭科、白鮭屬的一種冷水性、濾食性魚類。于1998年從俄羅斯引種并投放到新疆賽里木湖[1]。高白鮭以西藏?cái)M鳋和鉤蝦等浮游動(dòng)物為食，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[2]，廣受消費(fèi)者青睞。

高白鮭生產(chǎn)加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，包括內(nèi)臟、魚頭、魚尾、脊骨等，其副產(chǎn)物的開發(fā)利用研究并不充分，大多用以飼料加工或者直接丟棄，這不僅造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，還會(huì)出現(xiàn)環(huán)境污染問題[3]。副產(chǎn)物中含有大量粗蛋白和粗脂肪，頭尾脂肪含量為18.26%，脊骨為31.27%，而由副產(chǎn)物提取的魚油富含多種生物活性物質(zhì)，如二十二碳六烯酸（DHA）、二十五碳烯酸（EPA）等，可以降低動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病[4]，預(yù)防老年癡呆癥[5]及阿爾茲海默病，輔助減輕抑郁癥[6]，預(yù)防糖尿病[7]、肺病和癌癥[8]，具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

傳統(tǒng)的加熱蒸煮法是我國(guó)魚油的主要提取方法[9]。但高溫降解熱敏和不穩(wěn)定的天然化合物，可能產(chǎn)生反式脂肪酸[10]，以降低魚油的品質(zhì)。酶水解法被認(rèn)為是綠色環(huán)保的提取方法[11]。其方法溫和，無溶劑殘留，工藝操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)分離油脂和蛋白質(zhì)，具有廣闊的市場(chǎng)前景。國(guó)內(nèi)外諸多科研人員對(duì)酶水解法提取魚油的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但尚未報(bào)道過關(guān)于高白鮭魚油的提取分析研究。因此，試驗(yàn)對(duì)高白鮭加工副產(chǎn)物頭尾和脊骨的酶水解法提取魚油工藝進(jìn)行研究，并對(duì)粗魚油進(jìn)行品質(zhì)分析，旨在獲得最佳提取工藝條件，提高副產(chǎn)物不同部位的開發(fā)利用，為高白鮭副產(chǎn)物的高值化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

高白鮭副產(chǎn)物（賽湖漁業(yè)科技開發(fā)有限公司）。

無水乙醇、石油醚（沸程30～60 ℃）、硫代硫酸鈉、乙酸（AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；環(huán)己烷（AR，上海麥克林生化科技有限公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-3E型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；B250智能數(shù)顯恒溫油水浴鍋（上海予卓?jī)x器有限公司）；Multifuge X1R型高速冷凍離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理

將高白鮭副頭尾和脊骨絞碎成魚糜后分別放入標(biāo)記好的自封袋中，置于-80 ℃超低溫冰箱中凍藏，備用。

1.2.2 酶水解法提取魚油

高白鮭頭尾（脊骨）魚糜→加蒸餾水→調(diào)pH→加酶→酶解→滅酶→離心→粗魚油

稱取20.0 g頭尾（脊骨）魚糜，加入一定量的蒸餾水，用2 mol/L的NaOH調(diào)pH，調(diào)節(jié)水浴溫度預(yù)熱10 min后加一定量木瓜蛋白酶，酶解至規(guī)定時(shí)間，于95 ℃滅酶7 min，按5 000 r/min離心20 min，上層為魚油。按照式（1）計(jì)算魚油的提取率。

式中：X為提取率，%；m為提取的魚油質(zhì)量，g；m0為原料中的脂肪含量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 酶種類對(duì)高白鮭不同部位魚油提取率的影響

稱取20.0 g頭尾（脊骨）魚糜，采用表1中的酶及條件進(jìn)行試驗(yàn)。其他酶解條件為料液比1∶1.5 g/mL（1∶2 g/mL）、加酶量1.6×104U。

表1 不同酶的反應(yīng)溫度及pH

1.2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

研究酶解時(shí)間4.0，4.5，5.0，5.5，6.0和6.5 h對(duì)魚油的提取率的影響。固定條件：料液比1∶1.5 g/mL（1∶2 g/mL）、加酶量2%（1.5%）、pH 5.5、酶解溫度55 ℃。

1.2.3.3 酶解溫度對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

研究酶解溫度45，50，55，60和65 ℃對(duì)魚油提取率的影響。固定條件：料液比1∶1.5 g/mL（1∶2 g/mL）、加酶量2.0%（1.5%）、酶解時(shí)間6 h（5 h）、pH 5.5。

1.2.3.4 加酶量對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

研究加酶量1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%對(duì)魚油提取率的影響。固定條件：料液比1∶1.5 g/mL（1∶2 g/mL）、酶解時(shí)間6 h（5 h）、pH 5.5、酶解溫度55 ℃。

1.2.3.5 pH對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

研究pH 4.5，5.0，5.5，6.0和6.5對(duì)魚油提取率的影響。固定條件：料液比1∶1.5 g/mL（1∶2 g/mL）、加酶量2%（1.5%）、酶解時(shí)間6 h（5 h）、酶解溫度55 ℃。

1.2.3.6 料液比對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

研究料液比1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0和1∶2.5 g/mL對(duì)魚油提取的影響。固定條件：加酶量2.0%（1.5%）、酶解時(shí)間6 h（5 h）、酶解溫度55 ℃、pH 5.5。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

固定酶解時(shí)間6 h（5 h）、pH 5.5，以高白鮭頭尾（脊骨）魚油提取率為目標(biāo)函數(shù)Y1（Y2），選擇酶解溫度X1（X4）、加酶量X2（X5）、料液比X3（X6）為自變量，進(jìn)行Box-Behnken三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)。頭尾（脊骨）魚油試驗(yàn)因素水平見表2（表3）。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平（頭尾）

表3 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平（脊骨）

1.2.5 理化指標(biāo)的測(cè)定

水分及其揮發(fā)物參照GB 5009.236—2016《動(dòng)植物油脂水分及揮發(fā)物的測(cè)定》中的第二法進(jìn)行檢測(cè)；過氧化值參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測(cè)定》中的第一法進(jìn)行檢測(cè)；碘價(jià)參照GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)；酸價(jià)參照GB 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》中的第一法（KOH計(jì)）進(jìn)行檢測(cè)；不溶性雜質(zhì)參照GB/T 15688—2008《動(dòng)植物油脂不溶性雜質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 脂肪酸組成的測(cè)定

參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測(cè)定》第二法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，取平均值。數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019、SPSS 17.0、Origin 2021b進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶種類對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

由圖1可知，不同種類的酶對(duì)魚油提取率有所影響，同種酶不同部位魚油的提取率也不同。因?yàn)槊阜N類的不同，對(duì)肽鍵的專一性也不同，故水解能力不同。

圖1 酶種類對(duì)高白鮭不同部位魚油提取率的影響

木瓜蛋白酶所提取的魚油提取率最高，頭尾（脊骨）魚油提取率為78.77%（81.88%）。故選取木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

圖2中，隨著時(shí)間的增加，脂肪細(xì)胞和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，從而釋放油脂，頭尾（脊骨）魚油酶解時(shí)間在6 h（5 h）時(shí)，魚油提取率最高，繼續(xù)增加酶解時(shí)間，提取率反而降低，并且魚油色澤加深。色素的生產(chǎn)可能是羰基化合物如PUFA氧化產(chǎn)生的醛類與氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)的結(jié)果，提取率降低可能是隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，脂質(zhì)發(fā)生氧化，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與氨基酸或蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生反應(yīng)[12]。Linder等[13]也證明隨著水解時(shí)間的增加，鮭魚頭中的脂肪提取率不會(huì)進(jìn)一步增加。不同部位最適時(shí)間不同，可能是因?yàn)楦甙柞q頭尾和脊骨水分、蛋白質(zhì)、脂肪含量不同，酶水解的時(shí)間受到原料自身的影響，故選取6 h（5 h）作為頭尾（脊骨）魚油的最適酶解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)高白鮭不同部位魚油提取率的影響

2.1.3 酶解溫度對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

圖3中，酶解溫度在55 ℃時(shí)，高白鮭頭尾、脊骨魚油的提取率最高，隨著酶解溫度繼續(xù)增加，提取率降低，可能因?yàn)槊附鉁囟壬咭院?，降低了木瓜蛋白酶的活性，?dǎo)致提取率下降。故酶解溫度選取55 ℃。

圖3 酶解溫度對(duì)高白鮭不同部位魚油提取率的影響

2.1.4 加酶量對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

由圖4可知，隨著酶添加量增多，頭尾（脊骨）的提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，頭尾加酶量2.0%、脊骨加酶量1.5%時(shí)魚油提取率最高。酶添加量的增多會(huì)導(dǎo)致水解度的增加，但不一定會(huì)使魚油的提取率增加。而水解度的增加會(huì)導(dǎo)致油脂釋放的過程中形成乳液，破壞脂質(zhì)釋放，降低提取率。這與李平等[14]研究木瓜蛋白酶提取三文魚魚皮油的結(jié)果一致。不同部位最適加酶量的不同是由于高白鮭頭尾和脊骨部位的蛋白質(zhì)含量不同，對(duì)酶的需求量也有所不同。故加酶量選取2%（1.5%）。

圖4 加酶量對(duì)高白鮭不同部位魚油提取率的影響

2.1.5 pH對(duì)頭尾（脊骨）魚油提取率的影響

由圖5可知，pH由4.5增加到5.5，魚油的提取率升高，pH的增加加大了蛋白質(zhì)的水解，破乳能力得到提高，在pH 5.5時(shí)達(dá)到最高，而繼續(xù)由pH 5.0增加到pH 6.5，魚油提取率降低，說明酶解環(huán)境有特定的pH范圍使酶發(fā)揮出最大功效，故選取pH 5.5為最適pH。

圖5 pH對(duì)高白鮭不同部位魚油提取率的影響

2.1.6 料液比對(duì)高白鮭副產(chǎn)物魚油提取率的影響

圖6中，頭尾（脊骨）料液比1∶1.5 g/mL（1∶2.0 g/mL）時(shí)提取效果最佳。加入一定量水后有利于酶與底物的充分水解，加入過量的水后降低了底物濃度，使酶解能力降低、提取率降低。頭尾與脊骨的水分不同導(dǎo)致水解過程中對(duì)水分的需求不同。故料液比選取1∶1.5 g/mL（1∶2.0 g/mL）。

圖6 料液比對(duì)高白鮭不同部位魚油提取率的影響

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 高白鮭頭尾魚油提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

使用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得回歸方程Y1=81.13-0.56X1+1.73X2-4.92X3-2.06X1X2+4.66X1X3+3.88X2X3-7.96-2.53-8.14。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表5可知，模型P值＜0.000 1，差異極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.077 8，差異不顯著，故該模型有效，可用來預(yù)測(cè)高白鮭頭尾魚油的提取率。模型中差異極顯著有一次項(xiàng)X3，二次項(xiàng)，，交互項(xiàng)X1X2，X2X3差異高度顯著，一次項(xiàng)X2，交互項(xiàng)X1X2，二次項(xiàng)差異顯著，X1差異不顯著。由F值可知，對(duì)高白鮭頭尾魚油提取率影響效果為料液比＞加酶量＞溫度。回歸決定系數(shù)R2=0.982 8，說明模型擬合效果較好，決定修正系數(shù)=0.960 8，表示真實(shí)試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性且試驗(yàn)較穩(wěn)定。模型預(yù)測(cè)的最佳試驗(yàn)條件為溫度54.27 ℃、加酶量2.08%、料液比1∶1.35 g/mL，將溫度參數(shù)微調(diào)為54.3 ℃，在其余條件不變的情況下進(jìn)行6次試驗(yàn)取平均值，高白鮭頭尾魚油的提取率為82.16%，與預(yù)測(cè)值相符合，驗(yàn)證了模型的可靠性。

表5 回歸模型方差分析

2.2.2 高白鮭脊骨魚油提取響應(yīng)面優(yōu)化工藝

回歸方程為Y2=83.80-3.84X4+0.77X5+3.44X6-1.99X4X5+4.33X4X6+0.68X5X6-9.55-4.20-4.56。

表7分析同表5分析。該模型有效，可用于預(yù)測(cè)高白鮭脊骨魚油的提取率。一次項(xiàng)X4，X6，交互項(xiàng)X4X6，二次項(xiàng)、、差異極顯著；X4X5差異高度顯著；X5差異顯著；X5X6差異不顯著。模型預(yù)測(cè)的最佳試驗(yàn)條件為溫度53.74 ℃、加酶量1.54%、料液比1∶2.15 g/mL，將溫度參數(shù)微調(diào)為53.7 ℃，在其余條件不變的情況下進(jìn)行6次試驗(yàn)取平均值，高白鮭脊骨魚油驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為84.66%，與預(yù)測(cè)值相符，模型可靠。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 回歸模型方差分析

2.3 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)最佳工藝條件下的頭尾魚油和脊骨魚油，進(jìn)行理化指標(biāo)的分析。由表8可知，2種粗魚油均符合SC/T 3502—2016《魚油》粗魚油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表8 粗魚油理化指標(biāo)

2.4 脂肪酸組分分析

由表9可知，采用酶水解法提取的高白鮭頭尾、脊骨魚油共檢測(cè)出28種脂肪酸。其中，棕櫚油酸（C16∶1）和油酸（C18∶1n9c）含量最豐富，這與于淑池等[15]研究金鯧魚骨油中的脂肪酸結(jié)果一致。棕櫚油酸是一種有前途的抗炎脂質(zhì)[16]，可能有助于改善代謝紊亂。頭尾魚油和脊骨魚油中多不飽和脂肪酸分別為33.96%和35.86%。頭尾魚油、脊骨魚油單不飽和脂肪酸分別為38.82%和36.70%。頭尾魚油DHA、EPA含量為9.20%和8.08%；脊骨魚油DHA、EPA含量為9.65%和8.87%。預(yù)試驗(yàn)前期測(cè)得蒸煮法提取內(nèi)臟魚油的脂肪酸內(nèi)含有反式脂肪酸C18∶2n6t和C18∶1n9t，大量攝入反式脂肪可能對(duì)人類健康造成多種不利影響，包括心血管疾病、糖尿病和癌癥[17]。而試驗(yàn)均未在頭尾魚油和脊骨魚油中檢測(cè)到反式脂肪酸，可能是因?yàn)槊附夥ㄝ^為溫和，且酶解溫度較低。

表9 粗魚油脂肪酸組成及相對(duì)含量 單位：%

3 結(jié)論

以高白鮭加工副產(chǎn)物頭尾、脊骨為原料，魚油提取率為指標(biāo)，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面分析優(yōu)化法，得到木瓜蛋白酶水解提取高白鮭頭尾魚油最佳工藝條件：酶解溫度54.3 ℃、加酶量2.08%，料液比1∶1.35 g/mL、pH 5.5、酶解時(shí)間6 h。脊骨魚油最佳工藝條件為酶解溫度53.7 ℃、加酶量1.54%、料液比1∶2.15 g/mL、pH 5.5、酶解時(shí)間5 h。頭尾魚油和脊骨魚油在最佳條件下的提取率分別為82.16%和84.66%。2種魚油均符合水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3502—2016《魚油》粗魚油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；頭尾（脊骨）魚油脂肪酸組成中單不飽和脂肪酸38.82%（36.70%）、多不飽和脂肪酸33.96%（35.86%）、DHA 9.20%（9.65%）、EPA 8.08%（8.87%）。