王莉倩，寇宇星，溫毓秀，王蒙蒙，杜雙奎，于修燭*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院食品科學(xué)與工程系 上海 200240）

植物油容易發(fā)生氧化，導(dǎo)致油脂變質(zhì)。植物油品質(zhì)劣變的主要原因是自動(dòng)氧化，其被公認(rèn)為是一種由自由基引發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。根據(jù)自由基理論，整個(gè)氧化過(guò)程中伴隨著自由基的傳遞、引發(fā)以及含量的變化[1-4]。在自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)程中，先生成烷基自由基 （R·），R·與O2反應(yīng)生成過(guò)氧化自由基（ROO·），ROO·傳遞鏈反應(yīng)，形成大量氫過(guò)氧化物（ROOH），ROOH 容易發(fā)生氧化分解反應(yīng)形成次級(jí)氧化產(chǎn)物（醇、酸、酮和醛等），從而導(dǎo)致油脂酸敗變質(zhì)[5-8]。

電子順磁共振 （Electron paramagnetic resonance，EPR）是一種可直接測(cè)定自由基種類和含量的方法[9-11]。油脂氧化產(chǎn)生的自由基特別活潑，周期性短暫，需通過(guò)自旋加合物（自旋捕獲劑與自由基反應(yīng)所生成）來(lái)測(cè)定，常用的捕獲劑有N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）和5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）[11-13]。目前，EPR 在食品領(lǐng)域主要用于食用油的自由基監(jiān)測(cè)[11-15]，以及食品抗氧化能力的評(píng)價(jià)等[16-18]。Raitio 等[11]通過(guò)EPR 方法研究半固態(tài)棕櫚油早期氧化的特點(diǎn)。結(jié)果表明，半固態(tài)棕櫚油在50 ℃下貯藏7 d 的過(guò)程中，產(chǎn)生的自由基與次級(jí)氧化產(chǎn)物的形成呈正相關(guān)。李培等[13]研究了花生油加速氧化過(guò)程的自由基變化，結(jié)果表明，加速氧化過(guò)程中自由基含量由大到小為R·>RO·>ROO·。Chen 等[14]利用EPR 研究了溫度對(duì)棕櫚酸熱氧化的影響。采用烷基和烷氧基自旋加合物模擬試驗(yàn)光譜，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸從175 ℃到180 ℃的氧化速率迅速增加，表明棕櫚酸在一定溫度下的熱氧化是由自由基生成所致。Ottaviani 等[15]采用EPR 方法研究黑孜然籽油、芫荽籽油和小葵籽油中不同組分對(duì)自由基的清除能力，評(píng)估3 種油脂中不同成分的抗氧化能力。核磁共振氫譜（1H NMR） 能夠提供油脂脂肪酸中不同質(zhì)子氫的化學(xué)位移，它利用不同的質(zhì)子氫與相應(yīng)的脂肪酸建立起對(duì)應(yīng)關(guān)系，可快速、準(zhǔn)確測(cè)定油脂樣品中各質(zhì)子氫的含量[19-20]。這項(xiàng)技術(shù)提供了關(guān)于油在熱變質(zhì)過(guò)程中產(chǎn)生的許多變化的信息，不僅涉及?；慕到猓疑婕案鞣N氧化產(chǎn)物的形成和降解。

本文以4 種常見(jiàn)的植物油為研究對(duì)象，采用EPR 結(jié)合1H NMR 技術(shù)研究其在室溫氧化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基種類、總量以及各類自由基的變化情況。同時(shí)解析不同植物油中不飽和脂肪酸的1H NMR 在氧化前、后的變化，以期為植物油的自動(dòng)氧化自由基變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種植物油分別購(gòu)于國(guó)內(nèi)4 家油脂生產(chǎn)企業(yè)，均聲稱未添加任何抗氧化劑，具體信息如表1所示，主要脂肪酸組成如表2所示。不同油脂的主要脂肪酸組成不同，其中亞麻籽油中主要脂肪酸是亞麻酸；花生油中主要是油酸和亞油酸；葵花籽油中主要是亞油酸；油茶籽油中主要是油酸。

表1 樣品信息Table 1 Information of oil samples

表2 4 種植物油主要脂肪酸組成（%）Table 2 Composition of fatty acid in 4 vegetable oils （%）

異辛烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、氫氧化鉀、四甲基硅烷（TMS）、氘代氯仿（CDCl3）、DMPO（純度97%）等均為分析純級(jí)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EMX plus-10/12 電子自旋共振波譜儀，德國(guó)布魯克（Bruker）公司。主要技術(shù)參數(shù)：磁場(chǎng)強(qiáng)度為磁極距72 mm 時(shí)，最大1.45 T；掃場(chǎng)分辨率為128 000 點(diǎn)；微波頻率為X-波段，9.2～9.8 GHz；靈敏度為1.5×109自旋數(shù)/G；液氮變溫為100～700 K；液氦變溫為1.8～300 K。

Bruker Avance Ⅲ型核磁共振波譜儀，瑞士布魯克（Bruker）公司。規(guī)格：500 MHz；技術(shù)參數(shù)：1H分辨率為0.45 Hz。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 EPR 分析 準(zhǔn)確稱量一定的DMPO，采用甲苯溶解，使其終濃度為2.0 mol/L，置于-20 ℃中避光密封保存，待用。

分別取3 mL 的亞麻籽油、葵花籽油、花生油和茶籽油于50 mL 小燒杯中，使其暴露在空氣中，在室溫下自然氧化，每隔1 d 取200 μL 樣品置于核磁管中，加入20 μL 配好的DMPO 溶液，置于EPR 儀器諧振腔內(nèi)，采用如下檢測(cè)參數(shù)模式進(jìn)行檢測(cè)。

EPR 儀器的檢測(cè)參數(shù)：中心磁場(chǎng)為3 350.00 G，掃場(chǎng)寬度為100.00 G，掃場(chǎng)時(shí)間為20.0 s，微波功率為3.99 mW，調(diào)制幅度為1.000 G，轉(zhuǎn)換時(shí)間為10.00 ms，加熱溫度為373.15 K。然后打開(kāi)高純氮?dú)饬鞑㈤_(kāi)始加熱，待諧振腔溫度穩(wěn)定后，將核磁管置于諧振腔中，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔24 h 測(cè)定1次。

1.3.2 NMR 分析 將亞麻籽油、葵花籽油、花生油和油茶籽油暴露在空氣中 （模擬家用存儲(chǔ)條件），在室溫下自然氧化，取氧化前和氧化10 d 后的樣品進(jìn)行1H NMR 譜測(cè)定。分別取20～50 μL 的亞麻籽油、葵花籽油、花生油和茶籽油置于直徑5 mm 核磁管，以500 μL 氘代氯仿溶解，溶劑內(nèi)含0.03%四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)，混合均勻進(jìn)行檢測(cè)[21-22]。

通過(guò)壩外坡“之”字形斜馬道的方式修筑，以原壩體剖面外輪廓線為基準(zhǔn)設(shè)置“之”字形斜馬道，局部調(diào)整壩面坡度，同時(shí)提高壩體內(nèi)部碾壓系數(shù)確保壩體的安全穩(wěn)定，設(shè)置防護(hù)欄，調(diào)整坡腳的形式。這種建造方法不改變?cè)O(shè)計(jì)壩體內(nèi)外坡坡度，既能保證壩體的安全穩(wěn)定，避免壩外上壩道路因土石方開(kāi)挖、山體爆破帶來(lái)的邊坡處理等問(wèn)題，有利于降低施工干擾，控制工程量，減少生態(tài)環(huán)境破壞[3]。

1H NMR 測(cè)定條件參考楊登輝等[19]方法。具體參數(shù)為：每次測(cè)定都進(jìn)行調(diào)諧和勻場(chǎng)，溫度為297.3 K，工作頻率為400.13 MHz，采集時(shí)間為4.0895 s，光譜寬度為8 012.82 Hz，掃描16 次，空掃2 次。

1.3.3 過(guò)氧化值的測(cè)定 過(guò)氧化值的測(cè)定參考GB 5009.227-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

EPR 譜分析：自由基的自旋朗德因子（g 值）為自由基譜圖中心點(diǎn)，通過(guò)Xenon 軟件點(diǎn)擊譜圖中心點(diǎn)可以直接讀出g 值，脂類自由基的g 值都在2.0 附近。然后對(duì)樣品的自由基譜圖進(jìn)行基線校正，校正后進(jìn)行二次積分，使用Xenon 軟件自帶的自旋定量功能，可得到該樣品的自旋總數(shù)和自由基濃度。通過(guò)Xenon 軟件中的自旋擬合（Spin fit）功能對(duì)樣品的試驗(yàn)譜圖進(jìn)行計(jì)算機(jī)擬合，得到與試驗(yàn)結(jié)果相匹配的擬合結(jié)果，并以此為根據(jù)判定樣品中自由基的種類并進(jìn)行相對(duì)定量。

1H NMR 譜圖使用Topspin 軟件進(jìn)行處理，以四甲基硅烷內(nèi)標(biāo)物的峰作為化學(xué)位移零點(diǎn)，譜圖處理時(shí)以TMS 定位，譜圖經(jīng)校正零點(diǎn)后標(biāo)峰，并讀出峰面積。

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 9.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種植物油室溫氧化過(guò)程中過(guò)氧化值變化分析

過(guò)氧化值表示油脂和脂肪酸等被氧化程度的一種指標(biāo)，過(guò)氧化值越高其酸敗就越嚴(yán)重。在自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，一般來(lái)說(shuō)，多不飽和脂肪酸比單不飽和脂肪酸的反應(yīng)性更強(qiáng)。根據(jù)經(jīng)典的潤(rùn)滑脂理論，亞油酸的自氧化率約為油酸的10 倍，在0 ℃或更低的溫度下，亞油酸酯可被空氣氧化。4 種植物油室溫氧化過(guò)程中過(guò)氧化值變化結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4 種食用油室溫氧化中的過(guò)氧化值變化情況Fig.1 Peroxide values changes of 4 vegetable oils at room temperature

由圖1可知，這4 種植物油按氧化速率排序?yàn)椋簛喡樽延停净ㄉ停究ㄗ延停居筒枳延?。從自由基生成的角度?lái)看，雖然亞油酸產(chǎn)生自由基的速度比油酸快，但兩者之間的差異小于10 倍。在4 種油中，葵花籽油和茶籽油的過(guò)氧化值變化趨勢(shì)相對(duì)較小。在油脂的自動(dòng)氧化過(guò)程中，R·主要存在于自動(dòng)氧化的鏈傳遞階段，在這一階段不飽和脂肪酸中雙鍵旁亞甲基上的氫被奪取，形成大量的R·，由此，脂肪酸中的不飽和碳碳雙鍵越多，氧化時(shí)生成R·就越多，油脂就越容易氧化。

2.2 4 種植物油室溫氧化過(guò)程中自由基分析

2.2.1 植物油室溫氧化過(guò)程中自由基種類分析4 種植物油室溫氧化的譜圖如圖2所示，從上到下依次是試驗(yàn)譜圖（Exp）、擬合譜圖（Simu）及4 種擬合出的自由基譜圖。

圖2 4 種植物油室溫氧化的EPR 圖譜Fig.2 EPR Spectra of four kinds of vegetable oils oxidized at room temperature

如表3所示，根據(jù)4 種植物油的超精細(xì)耦合分裂常數(shù)（αN，αH），確定這些加合物分別是DMPO-X、R·、RO·、ROO·。

由圖2和表3可知，4 種植物油在室溫氧化過(guò)程中除油茶籽油外，其它植物油均產(chǎn)生了4 種自由基。而油茶籽油中只檢測(cè)到3 種自由基，分別是DMPO-X、RO·、ROO·。油茶籽油中可能含有極少量的R·，由于其含量過(guò)低與基線無(wú)異，難以擬合。Novakov 等[24]研究了體內(nèi)測(cè)定大鼠肝和肺提取物中的烷基自由基（R·），而未觀察到可檢測(cè)的烷基自由基，這是由它們的低穩(wěn)態(tài)濃度所致[25]。

表3 DMPO 捕獲的自由基EPR 參數(shù)Table 3 EPR parameters of radical adducts to DMPO

2.2.2 4 種植物油室溫氧化過(guò)程中自由基含量變化分析 4 種植物油的自旋總數(shù)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖3。

由圖3a 可以看出，容易氧化的亞麻籽油在第1 天時(shí)信號(hào)強(qiáng)度是4 種油中最低的，到第5 天時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度降到最低?？赡苁怯捎趤喡樽延椭凶钪饕闹舅崾莵喡樗幔鄬?duì)活躍，引發(fā)的自由基在短時(shí)間內(nèi)相互結(jié)合轉(zhuǎn)化為氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致DMPO捕獲到的自由基的量偏少[12]?；ㄉ驮诘? 天時(shí)其信號(hào)強(qiáng)度處于最低，這和亞麻籽油比較相似。而葵花籽油和油茶籽油的波動(dòng)幅度總體處于一個(gè)較低的水平。4 種植物油初始信號(hào)強(qiáng)度的變化趨勢(shì)不同，這是由于植物油中的脂肪酸種類和含量不同所致。4 種植物油中自由基含量在貯藏過(guò)程中是不斷變化和波動(dòng)的，說(shuō)明油脂氧化在不斷進(jìn)行[26]。

由圖3b 可以看出，亞麻籽油中波動(dòng)最明顯的自由基是DMPO-X，含量最多的也是DMPO-X。在0～6 d 時(shí)其自旋總量不同，樣品的自旋總量基本保持在較低水平。在6～7 d 時(shí)，所有自由基的自旋總量突然急劇增加。這可能是由于DMPO 容易受到O2影響，不斷發(fā)生反應(yīng)表現(xiàn)出波動(dòng)的狀態(tài)。到第10 天時(shí)均略有下降，這可能是由于新形成的自由基可以與穩(wěn)定的自旋加合物發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度減弱[27]。而烷氧基在整個(gè)氧化過(guò)程中都是在一個(gè)比較低的范圍內(nèi)波動(dòng)。由圖3c 可以看出，葵花籽油中含量最多的自由基是RO·，而且在氧化第1 天后含量急劇增加，在第2 天時(shí)又下降，處于一個(gè)不穩(wěn)定的狀態(tài)，這可能是由于氧化反應(yīng)進(jìn)一步加深，氫過(guò)氧化物不斷分解所導(dǎo)致[9，28]。其它3 種自由基一直維持在一個(gè)較低的水平上。由圖3d 可以看出，花生油中自由基按相對(duì)含量從高到低排序?yàn)镈MPO-X＞RO·＞R·＞ROO·。而且在氧化過(guò)程中RO·的數(shù)量在大幅度波動(dòng)，在1～2 d急劇上升，在3～4 d 時(shí)又呈下降趨勢(shì)。RO·在第4天之后一直呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，表明花生油正處于氫過(guò)氧化物二次引發(fā)階段[28]。由圖3e 可以看出，油茶籽油中的自由基主要是由R·組成，DMPO-X 的量次之，ROO·的量最少，而且在氧化前期R·的含量非常少以至于無(wú)法擬合，這與之前的EPR 圖譜相吻合。RO·一直處于動(dòng)態(tài)變化中，可能原因是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中氫過(guò)氧化物的分解。僅在氧化第9 天開(kāi)始出現(xiàn)R·且含量與ROO·相差無(wú)幾，基本處于同一水平。

圖3 4 種植物油自旋總數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.3 Changes of the total amounts of spins of four vegetable oils with time

2.3 4 種植物油室溫氧化前、后的1H NMR 分析

核磁共振氫譜1H NMR 是闡明脂質(zhì)初級(jí)和二級(jí)氧化產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)最常用的方法，它能提供化合物分子中氫原子的信息，可以分析油脂組成成分，探討油脂氧化過(guò)程中脂肪酸的變化等[29]，這對(duì)于全面認(rèn)識(shí)氧化過(guò)程和氧化機(jī)理意義重大。通過(guò)在氧化過(guò)程中監(jiān)測(cè)脂質(zhì)分子反應(yīng)位點(diǎn)的質(zhì)子峰，1H NMR 可用于評(píng)估脂質(zhì)氧化狀態(tài)，解析主要1H NMR 譜的化學(xué)位移信號(hào)的歸屬信息，見(jiàn)表4[30]。

表4 食用油核磁共振氫譜中各峰的歸屬Table 4 Signals of the 1H NMR spectra edible oil

2.3.1 亞麻籽油氧化前、后1H NMR 譜 亞麻籽油氧化前、后1H NMR 譜見(jiàn)圖4。

亞麻籽油和花生油的NMR 圖譜變化趨勢(shì)基本一致，以亞麻籽油的NMR 圖譜為例，如圖4所示。光譜在信號(hào)B 處是亞麻酸末端-CH3上的H，信號(hào)A、C、E 和A、G 分別與油酸、亞油酸含量有關(guān)[31]。結(jié)果表明，樣品的烯丙基質(zhì)子（E）、二烯丙基質(zhì)子（G）和烯質(zhì)子（J）的信號(hào)強(qiáng)度都有衰減。據(jù)報(bào)道，烯烴質(zhì)子與樣品中不飽和酯的含量有關(guān)。表明在室溫氧化降解過(guò)程中不飽和酯含量減少。同時(shí)，烯烴脂肪酸鏈與氧分子反應(yīng)良好，證實(shí)了樣品的降解[32]。同時(shí)花生油的不飽和脂肪酸（G）的信號(hào)積分區(qū)域明顯低于亞麻籽油的，由此可知，花生油相比于亞麻籽油具有較高的穩(wěn)定性。在室溫氧化10 d后，兩種油中并未檢測(cè)到主要的二級(jí)氧化產(chǎn)物醛（δ=9.2～9.9）的特征信號(hào)峰，說(shuō)明氧化正處于初級(jí)階段。

圖4 亞麻籽油氧化前（a）和室溫氧化10 d 后（b）的1H NMR 譜Fig. 4 1H NMR spectra of linseed oil before oxidation （a） and after 10 d oxidation at room temperature （b）

2.3.2 葵花籽油氧化前、后1H NMR 譜 葵花籽油氧化前、后1H NMR 譜見(jiàn)圖5。

葵花籽油和油茶籽油的NMR 圖譜變化趨勢(shì)基本一致，以葵花籽油的NMR 圖譜為例，如圖5所示。與亞麻籽油和花生油相比，葵花籽油整體信號(hào)強(qiáng)度均有降低?？梢钥闯?，隨著氧化時(shí)間延長(zhǎng)，亞油基?；ˋ 和G）對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度減弱。因此，在圖5可觀察到以δ=1.90～2.24 為中心的雙烯丙基質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度的下降，這主要是由于亞油基?；耓33]。根據(jù)María 等[34]的研究表明，亞油基?；慕到馑俣嚷愿哂谟退岬慕到馑俾?，PV 值的增長(zhǎng)趨勢(shì)也符合這一規(guī)律。同時(shí)在油茶籽油中，信號(hào)強(qiáng)度在δ=1.5 附近增加，這可能是由于與叔碳結(jié)合的氫原子濃度增加所致；后者可在交聯(lián)反應(yīng)中產(chǎn)生，在不同的?；溨g形成碳碳鍵，導(dǎo)致聚合物的形成[34]。樣品的烯丙基質(zhì)子、二烯丙基質(zhì)子和烯質(zhì)子的信號(hào)強(qiáng)度變化都很小，說(shuō)明氧化降解的速率和產(chǎn)量都很低。同樣的，在這兩種油中也沒(méi)有檢測(cè)到氫過(guò)氧質(zhì)子和二級(jí)氧化產(chǎn)物的特征信號(hào)，氧化處于初級(jí)階段，比較緩慢。

圖5 葵花籽油氧化前（a）和室溫氧化10 d 后（b）的1H NMR 譜Fig. 5 1H NMR spectra of sunflower seed oil before oxidation （a） and after 10 d oxidation at room temperature （b）

3 結(jié)論

亞麻籽油是4 種植物油中最易氧化的，其在室溫氧化時(shí)主要形成4 種自由基，按含量排序?yàn)镈MPO-X＞RO·＞R·＞ROO·?；ㄉ偷难趸俣葍H次于亞麻籽油，且其氧化自由基含量排序與亞麻籽油相似。葵花籽油的氧化速度略慢于花生油，其自由基含量排序?yàn)镽O·＞DMPO-X＞R·＞ROO·，且在氧化前期主要是烷氧自由基的含量在大幅度波動(dòng)，其它3 種自由基一直維持在一個(gè)較低的水平。油茶籽油穩(wěn)定性最高，其氧化自由基組成類似葵花籽油，主要是RO·，DMPO-X 次之，ROO·的量最少，且在氧化前期R·的量少以至于無(wú)法擬合?？偟脕?lái)說(shuō)，通過(guò)1H NMR 對(duì)4 種植物油的室溫氧化自由基進(jìn)行分析，得出氧化前、后氫質(zhì)子化學(xué)位移信號(hào)并沒(méi)有發(fā)生變化，而氧化前、后各特征峰的峰面積所占比例均有不同程度的變化。這與自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)、傳遞階段變化情況一致。并且通過(guò)EMR 和1H NMR 分析，發(fā)現(xiàn)自由基種類和含量與脂肪酸組成相關(guān)，且自由基增長(zhǎng)速度差別較大，與油脂的脂肪酸組成特征相吻合。在后續(xù)研究中，還需要結(jié)合自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的不同階段，探究自由基變化與氧化產(chǎn)物的關(guān)系。