王小壯，劉雙平，孫海龍，韓 笑，毛 健*，應(yīng)維茂

（1 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室 江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 江蘇無錫 214122 3 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122 4 國家黃酒工程技術(shù)研究中心 浙江紹興 312000）

在黃酒釀造過程中，霉菌提供了豐富的酶系，是必不可少的釀造微生物[1]。在工業(yè)化黃酒生產(chǎn)中，以純培養(yǎng)的黃曲霉SU-16 為主要糖化劑[2-4]，其中黃曲霉在熟麥曲中占到真菌群落結(jié)構(gòu)的75%以上，在接種的生麥曲中占到群落結(jié)構(gòu)的32.72%，在黃酒發(fā)酵過程中的相對含量>1%[5-6]，因此黃曲霉對黃酒的發(fā)酵至關(guān)重要。生物量是表征微生物生長情況的重要指標(biāo)，快速、準(zhǔn)確地測定生物量的變化，對于反映微生物的活性具有重要意義。然而，目前尚無對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的動態(tài)變化的定量分析。qPCR 利用熒光信號累積對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，通過實(shí)時監(jiān)測整個PCR 進(jìn)程，準(zhǔn)確定量樣品中微生物的生物量，同時具有操作簡便、專一性和靈敏度高、耗時短的優(yōu)勢，目前被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品[7-9]等領(lǐng)域中微生物的定量檢測。

黃酒發(fā)酵是一個復(fù)雜的發(fā)酵過程，發(fā)酵過程中微生物之間、環(huán)境與微生物之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系[10-11]。有研究指出pH 值、溫度、乙醇以及弱酸等環(huán)境因子會通過影響真菌生長，進(jìn)而影響其代謝活性來對發(fā)酵產(chǎn)生作用[12-15]。黃酒發(fā)酵采用間歇開耙的方式為微生物提供氧氣，同時微生物的活動產(chǎn)生大量的乙醇和有機(jī)酸，發(fā)酵醪中乙醇和有機(jī)酸的積累可能對黃曲霉的生長有一定影響。毛青鐘等[16]僅研究了黃酒發(fā)酵醪中抑制霉菌生長的因子，未深入研究黃曲霉的生長脅迫條件。

本研究基于qPCR 方法對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的動態(tài)變化進(jìn)行定量分析，解析發(fā)酵環(huán)境中主要代謝物質(zhì)對其生長的影響，以期為研究黃曲霉對黃酒發(fā)酵的貢獻(xiàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時可為研究其它釀造微生物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

1）試驗(yàn)過程中所用菌株黃酒酵母HJ 和黃曲霉SU-16 均為黃酒生產(chǎn)工業(yè)菌株；黃酒酵母用YPD 培養(yǎng)基，黃曲霉SU-16 用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基115 ℃高壓滅菌20 min 備用。

2）生麥曲和熟麥曲 （黃曲霉SU-16 純種麥曲）均取自紹興某黃酒廠，大米購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

3）所用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 無水乙醇、乳酸、乙酸、無水葡萄糖等試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母膏、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、TB Green Mix、溶菌酶、溶壁酶和蛋白酶K，無錫博瑞康有限公司；試驗(yàn)所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Legend Micro 17R 冷凍高速離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；DM500 RH 生物顯微鏡，德國徠卡顯微系統(tǒng)公司；Universal HoodⅡ凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Q5000 超微量紫外分光光度計(jì)，美國QUAWEⅡ公司；Qtower 3.0 熒光定量PCR 儀，德國耶拿分析儀器股份公司；KC/HWS-250PY 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海凱測實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒發(fā)酵與取樣 參照黃酒發(fā)酵工藝[17]在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬黃酒發(fā)酵。使用生麥曲、熟麥曲、酒母、米飯和水混合落料（按照表1配料添加），落料溫度28 ℃，前酵溫度30 ℃±2 ℃發(fā)酵120 h，每天開耙不少于1 次，頭耙時間為8～10 h；后酵15 ℃±2 ℃發(fā)酵408 h。發(fā)酵試驗(yàn)在5 L 體系中進(jìn)行，每個試驗(yàn)3 個平行。分別在發(fā)酵0，24，48，72，96，120，168，240，312，432，528 h 后充分?jǐn)嚢杌靹? min，用無菌取樣袋取樣100 g。

表1 黃酒模擬發(fā)酵體系Table 1 Huangjiu simulated brewing system

1.3.2 理化指標(biāo)的檢測 參照GB/T 13662-2018《黃酒》[18]進(jìn)行總酸（以乳酸計(jì)）、氨基態(tài)氮和酒精度的測定，采用3，5-二硝基水楊酸比色法[19]測定還原糖的含量。

1.3.3 熒光定量PCR 測定黃曲霉的生物量

1）黃曲霉的引物篩選及特異性驗(yàn)證 真菌的ITS 區(qū)域和β-微管蛋白基因序列常被用于曲霉屬微生物的鑒定[20]。通過文獻(xiàn)查閱選擇這2 個區(qū)域，針對黃曲霉的特異性引物（表2），通過NCBI提供的Primer-Blast 功能模擬比對，選出特異性高且擴(kuò)增產(chǎn)物在100～200 bp 的引物。以黃酒生產(chǎn)中篩選到的14 種真菌為模板，對該引物進(jìn)行PCR特異性試驗(yàn)驗(yàn)證。PCR 反應(yīng)體系：2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase 12.5 μL、上下游引物各10 mmoL、模板100 ng，補(bǔ)充ddH2O 至25 μL；PCR 反應(yīng)程序：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s 共30 個循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，16 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。

表2 黃酒釀造中黃曲霉的引物篩選Table 2 Screening of primers for A.flavus in Huangjiu brewing

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將黃曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，待長滿孢子收集制成孢子懸浮液，參照文獻(xiàn)[8]和[9]的方法以Ct 值（即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）為橫坐標(biāo)，生物量（103～108）的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過擴(kuò)增效率（Eff=10（-1/b）-1，95%～105%）和可信度（R2）來衡量標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性，其中b 是標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[24]。qPCR 反應(yīng)體系：2×TB Green Mix 10 μL，上下游引物各10 mmoL，模板100 ng，補(bǔ)充ddH2O 至20 μL；qPCR 反應(yīng)程序：95 ℃90 s，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)，然后從60 ℃升溫至95 ℃，每隔1 ℃讀1 次板，每次讀板維持10 s，繪制熔解曲線。

3）DNA 的提取 稱取5 g 發(fā)酵醪樣品，液氮研磨后轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，加入無菌水10 mL，混勻振蕩30 min，超聲5～10 min 后離心（1 000 r/min，4 ℃，10 min），取上清，洗滌2 次。將所得上清液高速離心（12 000 r/min 離心10 min）后向沉淀中加入5 mL 無菌水，采用SDS-CTAB 抽提法[25]提取黃酒發(fā)酵醪預(yù)處理樣品的基因組。

4）樣品測定 將樣品DNA 濃度稀釋到合適濃度后，分別使用黃曲霉特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，測定Ct 值，按照1.3.3（2）節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生物量。

1.3.4 通氧量對黃曲霉SU-16 生長的影響 取1 mL（約1.0×107spores/mL）黃曲霉SU-16 孢子懸浮液接種于100 mL 黃酒模擬液[26]培養(yǎng)基中，分別置于搖床（28 ℃，150 r/min）以及培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)120 h，培養(yǎng)箱中每隔12 h 搖勻3 min，每隔24 h取樣按照1.2.3 節(jié)的方法測定黃曲霉SU-16 生物量的變化。

1.3.5 發(fā)酵因素對黃曲霉SU-16 生長的影響

1）乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響 將含有不同乙醇含量（1%，3%，5%，8%，12%vol）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒平板，晾干平板。

2）乳酸對黃曲霉SU-16 生長的影響 將含有不同質(zhì)量濃度乳酸（2，4，6，8 g/L）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒平板，晾干平板。

3）乙酸對黃曲霉SU-16 生長的影響 將含有不同質(zhì)量濃度乙酸（2，4，6，8 g/L）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒平板，晾干平板。

在以上平板正中間放置1 個直徑6 mm 的濾紙片，吸取3 μL （約1.0×107spores/mL） 黃曲霉SU-16 孢子懸浮液滴于濾紙片上，立即用封口膜密封，28 ℃培養(yǎng)120 h，每隔24 h 采用十字交叉法測量菌落直徑，各3 個平行。

1.3.6 乙醇/乳酸/乙酸對黃曲霉SU-16 生物量的影響 分別配制不同濃度的乙醇 （1%，3%，5%，8%，12%vol）、乳酸（2，4，6，8 g/L）和乙酸（2，4，6，8 g/L） 黃酒模擬液，吸取1 mL （約1.0×107spores/mL）黃曲霉孢子懸浮液加入黃酒模擬液中恒溫28℃培養(yǎng)，每隔12 h 搖勻3 min，每隔24 h 取樣按照1.3.3 節(jié)的方法測量黃曲霉SU-16 生物量的動態(tài)變化，各3 個平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 7、qPCRsoft（Version 4.0）和Excel（Version 2013）進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)和黃曲霉的動態(tài)變化

2.1.1 黃酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的動態(tài)變化 黃酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化如圖1所示，隨著發(fā)酵時間的延長，樣品中的還原糖含量降低，酸度和乙醇升高，理化指標(biāo)在前酵（28 ℃，0～120 h）過程中，尤其是0～48 h 變化較大，120 h 時發(fā)酵醪液中總酸含量為（3.51 ± 0.11）g/L，氨基態(tài)氮含量為（1.24±0.02）g/L，還原糖含量為（28.74±1.01）g/L，乙醇含量為15.27%±0.51%vol。由于原料在前酵過程中被充分利用，后酵（15 ℃，120～528 h）過程理化指標(biāo)基本趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束后（528 h），發(fā)酵醪液中總酸含量為（3.82 ± 0.33）g/L，氨基態(tài)氮含量為（1.83 ± 0.05）g/L，還原糖含量為（28.65 ±3.87）g/L，乙醇含量為16.03%±0.93%vol。

圖1 黃酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes of Huangjiu brewing

陳青柳等[27]對機(jī)械化黃酒釀造發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)進(jìn)行動態(tài)檢測，發(fā)現(xiàn)理化指標(biāo)在0～48 h變化最為迅速，后酵過程中理化指標(biāo)變化緩慢趨于穩(wěn)定，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。周佳冰等[17]研究了不同黃酒酵母發(fā)酵過程理化指標(biāo)的變化曲線，理化指標(biāo)均在前酵過程中快速變化，后酵趨于穩(wěn)定，說明理化指標(biāo)的變化主要在前酵過程中。

2.1.2 黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉生物量的變化 通過Primer-blast 模擬比對，排除特異性較差的引物β-Tub-F/R，引物Af-F/R 特異性高而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為73 bp，因此以黃酒生產(chǎn)中篩選到的14 種真菌為模板，對引物Ao-F/R 進(jìn)行特異性驗(yàn)證，黃酒釀造中的真菌主要有酵母屬、曲霉屬以及笄霉屬[6]，米曲霉是由黃曲霉馴化而來，被認(rèn)為是黃曲霉亞種，因此在定量黃曲霉過程中Ao-For/Rev 可以擴(kuò)增黃曲霉和米曲霉，瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增得到的產(chǎn)物長度與目的基因長度相符（圖2）。生物量的測定參考路虎和陳筆等[8-9]建立的qPCR 方法，經(jīng)qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)熔解曲線呈現(xiàn)單一熔解峰（圖3a），說明產(chǎn)物特異性良好，無非特異性擴(kuò)增；然后以黃曲霉孢子濃度與Ct 值做標(biāo)準(zhǔn)曲線 （圖3b），結(jié)果具有良好的線性關(guān)系，R2大于0.999，斜率為-0.3137，對應(yīng)的擴(kuò)增效率為105%，滿足qPCR 的基本要求。經(jīng)過適用性驗(yàn)證，回收率在86%以上，能夠較準(zhǔn)確的將添加的黃曲霉進(jìn)行定量分析，說明該方法適用于黃酒體系中黃曲霉生物量的定量分析。

圖2 引物擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of PCR products

圖3 黃曲霉的熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Melting curve and standard curve of A.flavus

采用qPCR 方法對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的生物量進(jìn)行跟蹤檢測。結(jié)果如圖4所示，黃曲霉的生物量變化在0～24 h 變化最大，48 h 時增殖到105.87CFU/g，生物量達(dá)到最高，之后呈波動下降趨勢，發(fā)酵結(jié)束后生物量降低至104.37CFU/g，低于初始接種量，黃曲霉在發(fā)酵過程中呈先增后降的變化趨勢。路虎等[8]和Chen 等[9]的研究結(jié)果顯示，塔賓曲霉和鏈霉菌均在制曲階段微生物明顯增加，在堆積/酒醅發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行生物量有所減少；蔡琪琪等[28]采用PCR-DGGE 結(jié)合qPCR 定量檢測的方法發(fā)現(xiàn)紅曲霉在釀酒過程中被抑制。黃曲霉的生物量增加發(fā)生在發(fā)酵初期（0～48 h），此階段發(fā)酵環(huán)境發(fā)生變化，乙醇含量從0%vol 升高至10%vol 以上，總酸含量由（0.9±0.07）g/L 升高至（3.83±0.04）g/L，之后在一定的乙醇（>10%vol）和酸度（>4 g/L）的發(fā)酵環(huán)境中，黃曲霉的生物量開始下降。說明發(fā)酵環(huán)境的變化可能影響到了黃曲霉的生長。

圖4 黃酒發(fā)酵中黃曲霉生物量的變化Fig.4 Changes of A.flavus biomass during Huangjiu brewing

2.2 乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響

乙醇是黃酒發(fā)酵的重要代謝產(chǎn)物，占到發(fā)酵環(huán)境的0～17%vol，在前酵過程中乙醇快速增加，至120 h 乙醇可增加至10%vol 以上。乙醇的含量不僅影響黃酒的品質(zhì)，還會對微生物有一定的抑制作用[28]。乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響如表3和圖5所示，隨著乙醇含量的增加，黃曲霉SU-16 的生長均呈下降趨勢，與對照組（0%vol）相比，添加乙醇均對菌落生長產(chǎn)生顯著影響 （P<0.05）（圖5a），其中乙醇含量≥5%vol 時，嚴(yán)重影響到了孢子的萌發(fā)（表3）。乙醇含量為1%vol 時，對黃曲霉SU-16 生物量的影響差異不顯著（P>0.05），而乙醇含量為3%vol 時，對黃曲霉SU-16 的生物量影響顯著（P<0.01），當(dāng)乙醇含量≥5%vol 時，黃曲霉SU-16 生物量變化呈下降趨勢（圖5b）。因此，可以確定黃酒發(fā)酵的代謝產(chǎn)物（乙醇） 對黃曲霉SU-16 的生長具有顯著的影響，其中乙醇含量≥5%vol 時，嚴(yán)重影響到了孢子的萌發(fā)。

表3 乙醇對黃曲霉SU-16 生長的影響Table 3 Effects of ethanol on the growth of A.flavus SU-16

圖5 乙醇對黃曲霉SU-16 生物量的影響Fig.5 Effects of ethanol contents on the growth of A.flavus SU-16

黃永光等[29]對醬香白酒中曲霉菌進(jìn)行分離并研究Aspergillus hennebergii 酶分泌脅迫條件，結(jié)果顯示乙醇含量>8%vol 時，對Aspergillus hennebergii 的生長和產(chǎn)酶存在抑制；蔡琪琪等[28]研究結(jié)果顯示發(fā)酵初期的酒精度（<4%vol）對紅曲霉無影響，而隨著酒精度的增加，紅曲霉的生長逐漸受到抑制；Vinayavekhin 等[14]對黑曲霉的乙醇耐受性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示黑曲霉對乙醇的耐受濃度為5%vol。由此可見，不同菌株對乙醇的耐受性不同，黃曲霉SU-16 的乙醇耐受能力在5%vol 左右。然而黃曲霉對于乙醇脅迫的耐受機(jī)制尚不明確，這對其在黃酒釀造中生存和適應(yīng)高乙醇環(huán)境至關(guān)重要。乙醇是一種小的二碳醇，易溶于水和脂類環(huán)境，可以通過增加膜的流動性而通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，這種膜流動性的增加導(dǎo)致膜完整性的喪失，從而增加滲透性，同時乙醇還會改變線粒體的結(jié)構(gòu)，降低ATP 的水平和細(xì)胞呼吸頻率，并促進(jìn)乙醛和活性氧的生成，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷和氧化應(yīng)激，最終降低細(xì)胞活力[30]。馬龍等[31]研究了米曲霉響應(yīng)乙醇脅迫機(jī)制，結(jié)果表明乙醇可能引起了細(xì)胞內(nèi)部的變化，如細(xì)胞核不規(guī)整和空泡的增加，對菌絲生長和分生孢子形成產(chǎn)生抑制作用，并且這種抑制作用隨著乙醇含量的增加而顯著增強(qiáng)。

2.3 有機(jī)酸對黃曲霉SU-16 生長的影響

有機(jī)酸是黃酒發(fā)酵過程中重要的呈味和呈香物質(zhì)，同時具有一定的抑制雜菌的作用[15]，總酸含量不斷增加，其中含量最多的有機(jī)酸為乳酸和乙酸[32]，乳酸占到總酸含量的75.30%，乙酸占到總酸的8.59%。乳酸和乙酸對黃曲霉SU-16 生長的影響如表4和圖6所示，隨著乳酸和乙酸濃度的增加，黃曲霉SU-16 的生長均呈下降趨勢，與對照組（0 g/L）相比，添加乳酸和乙酸均對菌落生長和生物量產(chǎn)生顯著影響（P<0.05），然而乳酸的添加不能完全抑制到孢子的萌發(fā)，當(dāng)乙酸≥4 g/L 時，孢子不能萌發(fā)，生物量不斷下降，因此，可以確定乳酸和乙酸的添加對黃曲霉SU-16 的生長具有顯著影響，同時黃曲霉SU-16 對乳酸的耐受大于8 g/L，對乙酸的耐受界于2～4 g/L 之間。

圖6 有機(jī)酸對黃曲霉SU-16 生物量的影響Fig.6 Effects of organic acid on the growth of A.flavus SU-16

表4 有機(jī)酸對黃曲霉SU-16 生長的影響Table 4 Effects of organic acid on the growth of A.flavus SU-16

有機(jī)酸不同于強(qiáng)酸，以非解離形式存在，這種形態(tài)可以自由滲透到微生物質(zhì)膜中，進(jìn)而產(chǎn)生胞內(nèi)酸化抑制微生物生長[33]。乙酸的毒性作用嚴(yán)重影響微生物生長與物質(zhì)代謝過程，Casey 等[15]研究顯示乙酸能夠抑制釀酒酵母對葡萄糖與木糖的利用，從而抑制其生長；León 等[34]研究了不同濃度乙酸和乳酸對黃曲霉的影響，結(jié)果顯示非產(chǎn)毒黃曲霉對乙酸的耐受濃度為41.6 mmol/L （約2.498 g/L），對乳酸耐受濃度為357.7 mmol/L（約32.222 g/L）[35]，以上研究結(jié)果與黃曲霉SU-16 乙酸耐受性相似，而乳酸耐受性仍有待進(jìn)一步探究；同時鄧楠[35]研究了釀酒酵母的乳酸耐受機(jī)制，結(jié)果顯示當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度為40 g/L 時，嚴(yán)重影響到了釀酒酵母的產(chǎn)乙醇代謝特性[36]，說明乙酸對菌株的毒害作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于乳酸。

2.4 間歇通氧對黃曲霉SU-16 生長的影響

黃酒發(fā)酵過程中會通過間歇開耙來為微生物提供一定的氧氣，因此采用搖瓶培養(yǎng)以及間歇搖瓶培養(yǎng)的方式探究通氧量對黃曲霉SU-16 生長的影響，如圖7所示，在搖瓶培養(yǎng)條件下24～36 h時，黃曲霉SU-16 的生物量快速增加，之后緩慢增加。而在間歇搖瓶培養(yǎng)條件下36～48 h 時，孢子萌發(fā)開始產(chǎn)生大量菌絲，生物量快速增加。因此通氧量會影響到黃曲霉SU-16 孢子的萌發(fā)速率以及菌絲生長的速率，然而120 h 時2 種培養(yǎng)條件下黃曲霉SU-16 生物量差異不顯著，由此可以推斷黃酒發(fā)酵的微氧環(huán)境會對黃曲霉的生長速率產(chǎn)生一定影響，然而對最終生物量影響不顯著（P＞0.05），說明間歇通氧的方式可以滿足黃曲霉生長所需氧氣量。因此，通氧量不是影響黃酒發(fā)酵體系中黃曲霉生長的主要因素。蔡琪琪等[28]探究了溶氧量對紅曲霉生長的影響，結(jié)果顯示在封壇后發(fā)酵體系中殘留的氧氣仍可以滿足紅曲霉的生長，結(jié)果與本試驗(yàn)一致。因此可以確定發(fā)酵環(huán)境中的乙醇和有機(jī)酸類物質(zhì)是影響黃曲霉生長的主要因素。

圖7 通氧量對黃曲霉SU-16 生物量的影響Fig.7 Effect of oxygen supply on biomass of A.flavus SU-16

3 結(jié)論與討論

黃曲霉被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)過程中以加快發(fā)酵的進(jìn)行，對黃酒的發(fā)酵至關(guān)重要。生物量是表征微生物生長情況的重要指標(biāo)，運(yùn)用qPCR 方法對黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示在0～24 h 這段時間內(nèi)，黃曲霉生物量的變化最大，然而也只是增加了1 個數(shù)量級，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵醪液中乙醇和酸度含量上升（圖1），嚴(yán)重抑制了黃曲霉的生長和代謝，使其開始趨于不斷下降的趨勢，因此制曲階段是黃曲霉生長的必要階段，而發(fā)酵階段不利于黃曲霉的生長?；诎―GGE、高通量測序、宏基因組測序等在內(nèi)的免培法研究黃酒發(fā)酵環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明，黃曲霉是黃酒發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)組成中的優(yōu)勢物種[5-6]，其在黃酒發(fā)酵過程中的生態(tài)學(xué)意義、功能信息已有大量報(bào)道[6，33]，研究普遍發(fā)現(xiàn)，霉菌呈先減少后增加的變化趨勢[6，37]，其中曲霉屬占到霉菌的94%～99%；然而，與以往的研究結(jié)果不同，基于qPCR 檢測黃曲霉SU-16 的結(jié)果表明，黃酒發(fā)酵過程中黃曲霉的生物量一直處于較低水平，呈先增加后減少的趨勢，這主要是由于高通量測序表示物種的相對豐度，受到整體微生物含量的影響（例如：黃酒發(fā)酵初期黃酒酵母快速增加，隨著發(fā)酵時間的延長黃酒酵母急劇減少，對物種相對豐度影響較大），而qPCR 表示物種的絕對含量，不受其它物種的影響。同時，已有大量研究報(bào)道的白酒釀造微生物相關(guān)的研究也證明了這一點(diǎn)，基于擴(kuò)增子測序和宏基因組測序報(bào)道的部分物種的豐度與其絕對定量結(jié)果存在明顯差異[9，38]。因此，發(fā)酵環(huán)境中微生物的研究不能脫離微生物的生長情況，基于免培法的測序手段解析發(fā)酵過程中微生物物種組成、功能信息等的研究存在一定的缺陷[39-40]。

通過發(fā)酵間歇通氧以及發(fā)酵代謝產(chǎn)物（乙醇和有機(jī)酸） 對黃曲霉SU-16 的生長影響探究，結(jié)果表明黃酒發(fā)酵過程中間歇通氧可以滿足黃曲霉SU-16 的生長耗氧需求，乙醇、乳酸和乙酸均對黃曲霉SU-16 的生長有影響，其中乙醇為3%vol，乳酸為2 g/L，以及乙酸為2 g/L 時即影響顯著，主要表現(xiàn)為影響了孢子萌發(fā)和菌絲生長。微生物的脅迫作用一方面通過改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或者線粒體活力[30]，一方面通過滲透作用引起細(xì)胞死亡[33]，隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇和有機(jī)酸不斷積累，然而微生物耐受能力有限，黃曲霉SU-16 對于乙醇的耐受能力為5%vol，在發(fā)酵48 h，乙醇含量達(dá)到11.24% ± 0.74%vol，此時乙醇含量超過黃曲霉SU-16 的耐受能力，所以生物量開始不斷下降；黃曲霉SU-16 對乳酸的耐受能力>8 g/L，對乙酸的耐受能力界于2～4 g/L，黃酒發(fā)酵過程中乳酸呈先快速增加后緩慢增加的趨勢，發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到（5.57 ± 0.20）g/L，乙酸呈先升后降的趨勢，在120 h 時最高達(dá)到（0.56 ± 0.02）g/L，因此在發(fā)酵過程中乙醇起到主要抑制黃曲霉生長的作用。乙醇和弱酸對黃曲霉生長影響的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究，以上研究結(jié)果可為黃酒發(fā)酵的精準(zhǔn)調(diào)控提供一定的指導(dǎo)，同時對其它微生物的相關(guān)研究具有借鑒意義。