吳相佚，劉澤朋，高婧昕，郭凱睿，毛學英

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室 北京 100083）

牛乳在膳食營養(yǎng)中占有重要地位，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等。乳蛋白的必需氨基酸種類齊全，配比合理，營養(yǎng)價值高。乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，兩者比例約為80∶20。牛乳蛋白，不易被嬰幼兒消化吸收，易引發(fā)過敏反應，這與其自身的組成和結(jié)構特點密切相關。酪蛋白在嬰幼兒胃內(nèi)酸性環(huán)境下易形成乳凝塊，消化緩慢[1-2]。另外，在牛乳乳清蛋白中β-乳球蛋白含量高，約為乳清蛋白總量的50%，而母乳不含β-乳球蛋白[3]。β-乳球蛋白中心形成疏水性結(jié)構，使其易于結(jié)合脂肪酸，導致β-乳球蛋白不易被胃腸道蛋白酶水解，在胃腸道停留時間長，從而引起消化不良且易發(fā)生過敏反應[4]。牛乳是八大過敏原之一，約有2%～3%的嬰幼兒甚至1%的成年人，在攝入乳蛋白后會發(fā)生過敏反應[5]。牛乳蛋白過敏會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、拒奶等現(xiàn)象，影響嬰幼兒的生長發(fā)育，癥狀嚴重時會引起過敏性休克，甚至死亡。建立適當?shù)娜榈鞍赘男苑椒ǎ蕴岣咂湎?，降低致敏性具有重要意義。

目前，主要通過物理改性、化學改性和酶法改性等方法處理乳蛋白，改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構，以達到改善蛋白質(zhì)功能特性的目的[6]。最常用的乳蛋白改性方法為熱處理，然而，在熱處理過程中，乳蛋白結(jié)構會發(fā)生不可逆改變，形成大分子聚合物，溶解度降低，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量[7]。過度加熱還會產(chǎn)生異味和有害物質(zhì)等[8]。超高壓作為一種非熱食品加工技術，通過作用于蛋白質(zhì)的疏水鍵、氫鍵等非共價鍵改變其高級結(jié)構，從而改善蛋白質(zhì)的功能特性[9]。超高壓處理后蛋白質(zhì)結(jié)構變得更加松散，暴露出更多的酶切位點，促進酶解反應[10-11]。經(jīng)超高壓處理后，乳清分離蛋白的體外消化率顯著提高[12]。經(jīng)400 MPa 處理后，乳清濃縮蛋白的酶解程度升高，且蛋白水解度隨超高壓處理時間的延長而增加[13]。400 MPa 處理30 min，能夠顯著提高乳清蛋白的消化率[14]。超高壓通過改變蛋白結(jié)構，達到降低乳清分離蛋白致敏性的效果[15]。然而，目前關于超高壓對乳蛋白消化性和致敏性影響的研究大多集中于單一乳蛋白，超高壓處理對乳蛋白濃縮物的消化特性和致敏性的影響鮮有報道。乳品加工過程中蛋白質(zhì)的相互作用也會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構和特性。本研究采用超高壓處理乳蛋白濃縮物，探究其結(jié)構、可消化性和致敏性的變化，為乳蛋白濃縮物的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳濃縮蛋白（Milk protein concentrate 80，MPC80）：蛋白含量為80%，脂肪含量為4%，乳糖含量為6%，灰分含量為8%，恒天然；胃蛋白酶、胰蛋白酶，美國Sigma 公司；十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N，N，N'-四甲基乙二胺，美國Amresco 公司；甘氨酸，北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設備

SHZ-88A 水浴恒溫振蕩器，北京天林恒泰科技有限公司；METTLER TOLEDO pH 計，梅特勒·托利儀器有限公司；酶標儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；RF-6000 熒光分光光度計，島津基團（香港）有限公司；MOS-500 圓二色譜儀，法國Bio-Logic 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 稱取一定量的MPC80，加入去離子水溶解，用磁力攪拌器在室溫下攪拌2 h使其充分水合，配制成40 mg/mL 的蛋白溶液，分別于0.1，300，400，500 MPa 壓力下保壓10 min。冷凍干燥后用于下一步分析。

1.3.2 游離巰基含量的測定 采用Ellman's DTNB 法測定MPC 的游離巰基含量[16]。稱取1.3.1節(jié)制備的蛋白樣品，加入去離子溶解，使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL。取1 mL 蛋白溶液，依次加入4.0 mL Tris-Gly 緩 沖 液Ⅰ （0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Gly，5 mmol/L EDTA，pH 值為8.0） 和50 μL 的Ellman's 試劑，混合均勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應15 min。反應后在412 nm 波長處測定體系的吸光值。采用公式（1）計算游離巰基含量：

式中，A412nm——為樣品在412 nm 波長下的吸光值；D——稀釋倍數(shù)；C——樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）。

Ellman's 試劑配制：稱取0.2 g DTNB，溶于50 mL Tris-Gly 緩沖液Ⅰ，避光4 ℃保存。

1.3.3 ANS 熒光探針法測定表面疏水性 采用ANS 熒光探針法[17]測定不同壓力處理后MPC 的表面疏水性。將1.3.1 節(jié)制備的蛋白樣品用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）溶解為0.2，0.4，0.8 mg/mL 的溶液，在2 mL 蛋白溶液中加入10 μL 的ANS（8 mmol/L），充分混勻。在激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，電壓400 V，夾縫寬度5 nm 的條件下，測定熒光強度。繪制熒光強度隨蛋白濃度變化曲線，曲線的初始段斜率即為樣品表面疏水性。

1.3.4 乳蛋白二級結(jié)構測定 采用圓二色光譜（Circular dichroism，CD）[18]法測定MPC 的二級結(jié)構。稱取適量1.3.1 節(jié)制備的蛋白樣品，加入去離子水充分溶解，配制成0.2 mg/mL 的溶液。圓二色光譜儀的掃描范圍為190～250 nm，樣品池光程1 mm，環(huán)境溫度25 ℃，掃描速度100 nm/min，譜帶寬度1.0 nm。以去離子水為空白對照。

1.3.5 模擬胃腸消化 用去離子水溶解樣品，制備40 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液，進行模擬胃腸消化，具體操作方法如下：

1）將不同壓力處理后的蛋白溶液的pH 值調(diào)節(jié)為2.0，按2%（質(zhì)量分數(shù)）酶與底物比加入胃蛋白酶，置于恒溫振蕩器中酶解2 h，期間控制溫度為37 ℃。其中一部分冷凍干燥待用，另一部分用于進一步酶解。

2）將上述用胃蛋白酶酶解2 h，蛋白溶液的pH 值調(diào)節(jié)為7.5，以2%（質(zhì)量分數(shù)）酶與底物比加入胰蛋白酶，置于恒溫振蕩器中酶解2 h，期間控制溫度37 ℃。酶解液冷凍干燥待用。

1.3.6 SDS-PAGE 電泳 根據(jù)Wang 等[19]的方法進行SDS-PAGE 電泳。稱取1.3.1 節(jié)和1.3.5 節(jié)制備的消化前、后的樣品，加入去離子水充分溶解，加入一定量的上樣緩沖液，使其質(zhì)量濃度為4 μg/μL，充分振蕩混勻，在沸水中加熱5 min。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。每孔上樣量為5 μL，90 V 電泳待Marker 條帶分開后，將電壓調(diào)整為110 V。電泳結(jié)束后將膠置于考馬斯亮藍中染色2 h，之后用脫色液過夜脫色。

1.3.7 抗原性的測定 乳清蛋白中β-乳球蛋白是主要的過敏原，顯著影響牛乳的過敏性[20]，因此主要測定超高壓處理后β-乳球蛋白的抗原性。β-乳球蛋白試劑盒操作步驟如下：每孔加100 μL 稀釋的包被抗體；室溫（20～25 ℃）孵育1 h；清洗平板5 次；每孔加入200 μL 封閉液；室溫孵育30 min；清洗平板5 次；向孔中加入100 μL 標準品或樣品；室溫孵育1 h；清洗平板5 次；每孔加100 μL稀釋的HRP 檢測抗體；室溫孵育1 h；清洗平板5次；每孔加入100 μL TMB 底物溶液；室溫下避光靜置15 min；每孔加入100 μL 反應終止液終止反應；450 nm 波長處檢測吸光值。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果以3 次重復試驗的“平均值±標準差”表示。采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。采用Independent samples Ttest 進行分析，比較2 組數(shù)據(jù)間是否具有顯著差異，

采用單因素方差分析（One Way ANOVA）伴隨Duncan's 多重比較，分析多組數(shù)據(jù)間是否具有顯著差異，P<0.05 時認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對MPC 蛋白聚合的影響

經(jīng)不同超高壓處理后MPC 的SDS-PAGE 圖譜如圖1所示。與對照組（泳道1）相比，經(jīng)超高壓處理后樣品的β-乳球蛋白條帶明顯變淺，而不同壓力處理后酪蛋白和α-乳白蛋白條帶深淺無明顯變化。觀察還原型電泳以及非還原型電泳的圖譜，可以看出非還原型電泳的膠孔處有聚集物，而該聚集物在還原型電泳的膠孔消失，提示經(jīng)過超高壓處理形成的β-乳球蛋白聚合物之間通過二硫鍵結(jié)合而成。100 MPa 以上的高壓處理會引起β-乳球蛋白變性，其變性程度隨壓力增加而增加，而α-乳白蛋白對壓力具有較強的耐受性，在高壓下的穩(wěn)定性高于β-乳球蛋白[21]；這是因為β-乳球蛋白含有2 個二硫鍵和1 個游離巰基，對壓力較敏感，而α-乳白蛋白不含有游離巰基[10]。Dimuthu等[22]通過SDS-PAGE 分析了不同高壓處理后α-乳白蛋白的聚集程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，α-乳白蛋白條帶沒有明顯變化，表明α-乳白蛋白未發(fā)生明顯聚集，與本研究結(jié)果一致。

圖1 不同壓力處理后MPC 的SDS-PAGE 圖譜Fig.1 SDS-PAGE of MPC treated with different high hydrostatic pressures

2.2 超高壓處理對MPC 游離巰基含量的影響

經(jīng)過超高壓處理后MPC 的游離巰基含量變化如圖2所示。隨著處理壓力升高，MPC 的游離巰基含量逐漸降低，在500 MPa 時達到最低。衛(wèi)永華等[23]發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白中游離巰基的含量隨超高壓處理壓力（0～500 MPa）的上升而下降，二硫鍵含量隨超高壓處理壓力升高而增加。此外，Hu 等[24]采用超高壓對α-酪蛋白進行處理，發(fā)現(xiàn)壓力升高后游離巰基含量下降。以上結(jié)果與本研究變化趨勢一致。說明超高壓處理誘導MPC 中游離巰基和二硫鍵之間發(fā)生交換反應，從而形成新的二硫鍵[25]。

圖2 不同壓力處理后MPC 的游離巰基含量Fig.2 The free sulfhydryl content of MPC treated with different high hydrostatic pressures

2.3 超高壓處理對MPC 表面疏水性的影響

經(jīng)過超高壓處理后MPC 的表面疏水性變化如圖3所示。經(jīng)過超高壓處理后MPC 的表面疏水性升高，且隨著超高壓處理強度的增加而升高。蛋白質(zhì)分子由氨基酸通過共價鍵連接，并由非共價鍵維持其高級結(jié)構，其中疏水相互作用在維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構中有重要地位[26]。蛋白質(zhì)表面疏水性可表征蛋白質(zhì)分子表面與極性環(huán)境的疏水基團數(shù)量，與其功能性質(zhì)密切相關，且在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構和四級結(jié)構中具有重要作用[27-28]。在水溶液中，ANS 與蛋白質(zhì)疏水區(qū)域結(jié)合后熒光強度會劇烈增加，此特性已被廣泛用作熒光探針測量蛋白質(zhì)的表面疏水性[29]。超高壓處理能使蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構打開，包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團暴露，表面疏水性升高[30]。龐佳坤等[25]發(fā)現(xiàn)200 MPa 以上的壓力能顯著提高乳清分離蛋白的表面疏水性；Liu 等[31]研究表明乳清濃縮蛋白（WPC）經(jīng)600 MPa 超高壓處理2.5 min 后，其表面疏水性提高了1.4 倍。以上研究結(jié)果與本研究的變化趨勢一致。

圖3 不同壓力處理后MPC 表面疏水性的變化Fig.3 Effect of different high hydrostatic pressures on the surface hydrophobicity of MPC

2.4 超高壓處理對MPC 二級結(jié)構的影響

經(jīng)超高壓處理后MPC 的二級結(jié)構變化如圖4所示，經(jīng)不同壓力處理后MPC 的圓二色圖譜變化趨勢相似（圖4）。根據(jù)圓二色譜數(shù)據(jù)，通過k2d算法計算樣品α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲結(jié)構的含量[32]，超高壓處理對MPC 二級結(jié)構含量的影響如圖5所示。由圖5可知，未經(jīng)處理的MPC 中二級結(jié)構以β-折疊和無規(guī)則卷曲為主，經(jīng)過300 MPa 處理后，MPC 的二級結(jié)構無明顯變化，而經(jīng)過400 MPa 和500 MPa 處理后，MPC 的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量逐漸降低，而β-折疊含量升高。

圖4 不同壓力處理后MPC 的圓二色譜Fig.4 Circular dichroism spectra of MPC treated with different high hydrostatic pressures

圖5 不同壓力處理對MPC 二級結(jié)構含量的影響Fig.5 Effect of different high hydrostatic pressures on the secondary structure content of MPC

2.5 超高壓處理對MPC 消化特性的影響

為明確超高壓處理對乳蛋白消化特性的影響，對經(jīng)超高壓（500 MPa）處理后MPC 進行胃腸模擬消化，胃腸模擬消化產(chǎn)物的SDS-PAGE 電泳分析圖譜如圖6所示。與未經(jīng)胃腸模擬消化的MPC 相比，經(jīng)胃消化后蛋白條帶變淺，樣品中完整蛋白含量減少（泳道2 與5），且在胃消化階段酪蛋白的消化程度高于乳清蛋白。經(jīng)過腸消化后（泳道3 與泳道6），0.1 MPa （即未經(jīng)超高壓處理的樣品） 與500 MPa 處理樣品的酪蛋白條帶消失；超高壓處理（500 MPa）MPC 的乳清蛋白條帶變淺，表明乳清蛋白消化率經(jīng)500 MPa 超高壓處理后提高。Hu 等[24]等報道經(jīng)超高壓處理后α-酪蛋白的消化率升高，經(jīng)200 MPa 處理5 min 其消化率從32.49%上升至48%。Iskandar 等[33]研究表明經(jīng)550 MPa 處理1 min，乳清蛋白的消化率顯著提高。這主要歸因于超高壓處理使蛋白結(jié)構變得松散，暴露出更多的酶切位點，從而增加其可消化性[34]。

圖6 超高壓MPC 體外胃腸模擬消化物的SDS-PAGE 圖譜Fig.6 SDS-PAGE of simulated gastrointestinal digested MPC after high hydrostatic pressure treatments

2.6 超高壓處理對乳蛋白致敏性的影響

用β-乳球蛋白的抗原性反映其致敏性的強弱。經(jīng)過超高壓處理及胃腸消化前、后MPC 的抗原性如圖7所示。與對照組相比，經(jīng)過超高壓處理后β-乳球蛋白致敏性顯著降低，且經(jīng)過胃腸模擬消化后，對照組和超高壓處理MPC 的致敏性均顯著下降，且超高壓處理MPC 經(jīng)過胃腸模擬消化后致敏性下降程度更顯著。乳蛋白的致敏性與其線性表位和構象表位有關，適當強度的超高壓處理引起的蛋白結(jié)構變化，會破壞構象表位，從而降低其致敏性[30]。Meng 等[20]發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白經(jīng)過500 MPa 處理后，其致敏性顯著降低，與本結(jié)果一致。本研究中，超高壓處理不僅提高了β-乳球蛋白的消化率，還使得腸道中殘留的β-乳球蛋白及β-乳球蛋白抗原表位含量降低，因此，超高壓處理降低了乳蛋白致敏性。

圖7 超高壓處理對胃腸模擬消化前、后β-乳球蛋白抗原性的影響Fig.7 Effects of high hydrostatic pressure on the allergenicity of β-lactoglobulin before and after simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié)論

經(jīng)過不同強度超高壓 （300 MPa/10 min，400 MPa/10 min 和500 MPa/10 min）處理后，乳蛋白濃縮物的蛋白聚合程度發(fā)生顯著變化，主要表現(xiàn)為β-乳球蛋白發(fā)生共價結(jié)合，且超高壓處理壓力越高，其共價結(jié)合程度越高。乳蛋白的游離巰基含量隨著處理壓力的升高而逐漸降低，然而乳蛋白的表面疏水性顯著升高。經(jīng)過400 MPa/10 min 和500 MPa/10 min 處理后，乳蛋白的二級結(jié)構含量發(fā)生顯著變化。經(jīng)過500 MPa/10 min 處理后，蛋白質(zhì)的可消化性顯著升高，且500 MPa/10 min 處理能夠顯著降低乳蛋白的致敏性。因此，超高壓處理能夠改變?nèi)榈鞍椎目臻g結(jié)構，從而提升其消化性并降低其致敏性。