劉 坤，郭 彤，王曉彬，程 華，李 娜，殷九一，戚翠蓮

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學數(shù)學與統(tǒng)計學院，河北 石家莊 050061；2.河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050061；3.天津科技大學生物工程學院，天津 300450；4.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081）

多酚是植物體內(nèi)重要的次級代謝產(chǎn)物[1]，在植物的生長發(fā)育、基因表達和信號傳導都有很大的作用。有研究表明，植物多酚具有抗菌[2-3]、控制血糖[4]、增強抗癌化療藥物的治療效率[5]等方面有一定作用。黃牛肝菌（Boletus speciosus），也稱作松蘑或者黃花松茸，是一種可食用真菌[6]，富含多糖、甾類、酚酸類及各種色素等成分[7-8]，具有較高的營養(yǎng)價值與藥用價值[9-11]。目前，對于黃牛肝菌多酚類物質(zhì)提取工藝及優(yōu)化的研究較少，采用單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化黃牛肝菌多酚的提取工藝，并檢測其抗氧化活性，為今后黃牛肝菌的進一步研究和利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃牛肝菌，購自云南省麗江；沒食子酸（分析純），上海金穗生物技術(shù)有限公司提供；鎢酸鈉，天津市源東化學試劑有限公司提供；鉬酸鈉（分析純），天津市福辰化學試劑廠提供；硫酸鋰（分析純），南京金留化玻儀器有限責任公司提供；雙氧水、無水乙醇（分析純），瑞康醫(yī)用科技有限公司提供；磷酸、碳酸鈉（分析純），天津市北辰方正試劑廠提供；無水硫酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；濃鹽酸（分析純），天津市大茂化學試劑廠提供；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法），上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要儀器

XFB-1000 型中藥粉碎機，吉首市中誠制藥機械廠產(chǎn)品；722 型分光光度計，上海析譜儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；TDL-60B 型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 福林酚試劑的配制

根據(jù)程啟斌等人[12]的方法配制福林酚試劑，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標準曲線的繪制

取10 mg 沒食子酸標準品蒸餾水溶解，置于100 mL 的容量瓶，定容得質(zhì)量濃度0.1 mg/mL 的標準溶液。分別量取標準溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，加超純水補充至2 mL，搖勻后分別加入1 mL 的福林酚試劑，2 min 后各加入2 mL 10%碳酸鈉溶液，混勻，用蒸餾水將其定容，在50 ℃水浴加熱黑暗條件下反應15 min，于波長765 nm 處測定吸光度。以標準液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，其線性方程為Y= 14.306X+0.017 6（R2=0.999 4），后續(xù)用每克黃牛肝菌沒食子酸當量計算多酚含量。

1.3.3 樣品中多酚的測定

準確吸取2 mL 樣品溶液，分別加入1 mL 福林酚試劑，質(zhì)量分數(shù)為10%的碳酸鈉溶液2 mL，蒸餾水定容至10 mL 后于50 ℃水浴中進行15 min 暗反應，冷卻后于波長765 nm 處測定吸光度。

1.4 單因素試驗

1.4.1 料液比對多酚提取量的影響

準確稱取0.1 g 黃牛肝菌粉末，按1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 的料液比溶于體積分數(shù)45%乙醇中，于35 ℃下超聲提取30 min ，探究不同料液比對多酚提取量的影響。

1.4.2 乙醇體積分數(shù)對多酚提取量的影響

準確稱取0.1 g 黃牛肝菌粉末，在料液比1∶10（g∶mL） 下分別溶解于體積分數(shù)35%，45%，55%，65%乙醇中，于35 ℃下超聲提取30 min，探究不同乙醇體積分數(shù)對多酚提取量的影響。

1.4.3 超聲時間對多酚提取量的影響

準確稱取0.1 g 黃牛肝菌粉末，按1∶40 的料液比溶于45%乙醇中，分別于35 ℃下超聲提取20，25，30，35，40 min，探究不同超聲時間對多酚提取量的影響。

1.4.4 超聲溫度對多酚提取量的影響

準確稱取0.1 g 黃牛肝菌粉末，按1∶40 的料液比溶于45%乙醇中，分別在30，35，40，45，50 ℃下超聲提取30 min，探究不同超聲溫度對多酚提取量的影響。

1.4.5 提取次數(shù)對多酚提取量的影響

準確稱取0.1 g 黃牛肝菌粉末，在料液比1∶10下溶解于45%乙醇中，在35 ℃超聲30 min 下分別提取1，2，3 次，探究不同提取次數(shù)對多酚提取量的影響。

1.5 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間為影響因素，多酚提取量為響應值，根據(jù)Box-behnken 模型進行響應面試驗設計。

響應面試驗自變量因素水平見表1。

1.6 抗氧化試驗

1.6.1 DPPH 自由基清除試驗

取定量DPPH 于試管中，分別加入不同質(zhì)量濃度（200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μg/mL）維C 和樣品溶液暗反應30 min 后，于波長517 nm下測定吸光度。自由基清除率的計算公式如下[13]：

式中：A1——空白吸光度；

A2——樣品吸光度。

1.6.2 清除ABTS 自由基能力的測定

采用總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法），以trolox 為標準品作出標準曲線，其線性方程為Y=-1.509 4X+0.586 4（R2=0.993 7），后續(xù)用牛肝菌多酚提取物的吸光度計算其對ABTS 自由基的清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 料液比的影響

5種料液比下多酚提取量分別為8.813，10.359，10.478，10.624，10.079 mg/g，當料液比為 1∶40 時得到黃牛肝菌多酚提取的最優(yōu)值。因此，選擇料液比1∶40 為最佳料液比。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)的影響

在不同乙醇體積分數(shù)下多酚提取量分別為8.521，9.092，8.736，7.841，7.755 mg/g，隨著乙醇體積分數(shù)增加，多酚提取量先增加后降低，在45%乙醇時最高。所以，選擇45%乙醇為最佳體積分數(shù)。

2.1.3 超聲時間的影響

在不同超聲時間下多酚提取量分別為9.415，9.780，10.168，9.929，9.157 mg/g，即超聲時間為30 min 時多酚提取量最高。所以，超聲時間定為30 min 進行下一步試驗。

2.1.4 超聲溫度對提取黃牛肝菌中多酚的影響

不同超聲溫度下多酚提取量為8.049，8.257，6.884，7.503，7.384 mg/g，在35 ℃時多酚提取量最高。所以，后續(xù)試驗在這個條件下進行。

2.1.5 提取次數(shù)對提取黃牛肝菌中多酚的影響

不同提取次數(shù)下多酚提取量分別為8.314，8.514，8.681 mg/g，3 次的結(jié)果差異不顯著，從多酚提取量和經(jīng)濟效益的角度考慮，選擇提取次數(shù)為1 次[14]。

2.2 響應面試驗設計結(jié)果

響應面試驗設計及結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

選取料液比（A）、乙醇體積分數(shù)（B） 和超聲時間（C） 為變量，選定黃牛肝菌多酚提取量為響應值，通過軟件進行擬合分析[15]，得到黃牛肝菌多酚提取量回歸方程：

對于上述回歸方程進行方差分析。

響應面方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應面方差分析結(jié)果

由表3 可知，所建立模型的p＜0.01，差異極顯著；失擬差p=0.309 8，差異不顯著，表明模型可靠性較高，試驗誤差較小，因此可以對黃牛肝菌多酚提取量進行分析和預測[16]。其中，提取時間達到極顯著水平，且乙醇體積分數(shù)、提取時間對多酚提取量的影響大于料液比。交互項AB 對結(jié)果影響顯著；二次項A2，B2，C2對結(jié)果影響均極顯著。

2.3 響應面分析

響應面圖的傾斜程度越大，表明響應值對因素的變化越敏感。反之，表明響應值對因素的變化不敏感[17]。

兩因素交互作用對多酚提取量影響的響應面曲線見圖1。

由圖1 可知，料液比、乙醇體積分數(shù)和提取時間與提取的多酚提取量存在一定相關性。經(jīng)過Design Expert 8.0.6 軟件對回歸方程進行多次回歸可知黃牛肝菌多酚最佳提取工藝為料液比1∶40.38，乙醇體積分數(shù)43.34%，超聲時間28.43 min，在此最優(yōu)條件下進行試驗，黃牛肝菌多酚提取量為10.497 μgGAE/g，與理論值10.469 μg GAE/g 較為一致，驗證了模型的可靠性。

圖1 兩因素交互作用對多酚提取量影響的響應面曲線

2.4 抗氧化活性

從DPPH 和ABTS 自由基清除活性2 個方面考查了黃牛肝菌多酚提取物的抗氧化活性。黃牛肝菌多酚提取物具有一定的DPPH 自由基清除活性，且DPPH 自由基的清除能力隨著其濃度的增加而增加（圖 2），其 IC50值為 53.64，與維 C 的 IC50值 4.05 差異顯著（p＜0.05）。ABTS 自由基清除試驗表明，黃牛肝菌多酚提取物樣品對ABTS 自由基清除能力達到0.525 trolox mmol/mg。

清除DPPH 自由基能力見圖2。

圖2 清除DPPH 自由基能力

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗得到黃牛肝菌中多酚最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)43.34%，料液比1∶40.38（g∶mL），超聲提取時間28.43 min，在此工藝條件下黃牛肝菌多酚提取量為10.497 μg GAE/g。通過DPPH 自由基清除、ABTS 自由基清除試驗表明，黃牛肝菌多酚提取液具有一定的抗氧化活性，為黃牛肝菌資源的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。