王 博

結腸癌是發(fā)生在結腸部位的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，病死率居惡性腫瘤第5位，40～50歲為高發(fā)年齡，男女之比為2∶1～3∶1[1]。隨著人類生活水平提高，飲食結構發(fā)生變化，結腸癌發(fā)病率逐年增加，嚴重影響人類生命安全[2]。腸道定植菌群在生理狀態(tài)下處于動態(tài)平衡，當這種平衡遭到打破，腸道定植菌群結構發(fā)生改變，腸黏膜免疫調節(jié)紊亂，腸道屏障功能出現(xiàn)異常，導致組織惡變。有研究認為[3]腸道定植菌群失調是誘發(fā)結腸癌的關鍵因素，但由于受到實驗條件、儀器精度、自身能力、研究方法等因素限制，現(xiàn)階段關于腸道定植菌群在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中作用的研究較少。因此本研究探討結腸癌患者腸黏膜組織定植菌群的結構變化及其與病情程度的相關性，以期為臨床防治結腸癌提供新的方向，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年11月至2020年11月我院收治的97例結腸癌患者為病例組，同期我院收治的97例結腸腺瘤患者為對照組。病例組：男性69例，女性28例；年齡40～80歲，平均年齡(56.23±5.45)歲；體質量指數(shù)(23.49±3.33)kg/m2；吸煙史34例；飲酒史39例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期46例；淋巴結轉移：無淋巴結轉移49例，有淋巴結轉移48例。對照組：男性70例，女性27例；年齡40～78歲，平均年齡(56.47±5.58)歲；體質量指數(shù)(23.51±3.25)kg/m2；吸煙史35例；飲酒史40例。2組年齡、性別、體質量指數(shù)、吸煙史、飲酒史等一般資料無顯著差異(P>0.05)。納入標準：①2組患者經病理活檢確診；②入院前未接受任何抗結腸癌、結腸腺瘤治療；③依從性好，能配合完成本研究；④所有研究對象對本研究內容知情了解，并簽訂知情同意書。排除標準：①病歷資料不詳細；②心、肝、腎、肺等重要臟器功能不全；③哺乳期或妊娠期女性；④合并其他腫瘤、其他胃腸道疾病、過敏性疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、傳染性疾病、心腦血管疾病、精神系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病。本研究上報我院醫(yī)學倫理委員會并獲得批準。

1.2 研究方法

記錄所有研究對象入院時的年齡、性別、體質量指數(shù)、吸煙史、飲酒史等一般資料，收集病例組手術切除的結腸癌組織和對照組手術切除的結腸腺瘤組織，采用基因組DNA提取試劑盒(北京凱瑞基生物科技有限公司)提取2組患者腸黏膜組織中基因組DNA，所提取的DNA采用分光光度計(東莞市譜標實驗器材科技有限公司)檢測其濃度和純度，對細菌16srRNA基因V4區(qū)進行PCR擴增，PCR擴增體系為：Primer (2 μM)3 μL；Phusion Master Mix (2×)15 μL；gDNA 10 μL，H2O2μL，總體積30 μL；PCR反應條件為：98℃預變性1 min，98℃變性10 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，39次循環(huán)。細菌16SrDNA的引物為：515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')/806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(上海勱瑞生物科技有限公司)對PCR產物純化，應用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(美國Promega公司)對PCR產物定量，應用Illumina Miseq平臺(武漢華大基因公司)進行高通量測序，應用COPE軟件(北京奧維森基因科技有限公司)統(tǒng)計樣品序列數(shù)目，在0.97相似度下應用QIIME序列分析軟件(北京環(huán)中睿馳科技有限公司)將序列聚類為用于物種分類的OTUs，結合物種組成信息結果，分析2組患者腸黏膜組織定植菌群結構及豐度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 2組患者腸黏膜組織定植菌群結構差異

門水平：病例組患者腸黏膜組織中厚壁菌門豐度顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；病例組患者腸黏膜組織中變形菌門豐度顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)屬水平：病例組患者腸黏膜組織中真桿菌屬豐度顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；病例組患者腸黏膜組織中梭桿菌屬豐度顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者腸黏膜組織定植菌群結構差異

2.2 不同臨床分期的結腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結構差異

門水平：Ⅲ～Ⅳ期結腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門豐度顯著低于Ⅰ～Ⅱ期結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期結腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門豐度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。屬水平Ⅲ～Ⅳ期結腸癌患者腸黏膜組織中真桿菌屬豐度顯著低于Ⅰ～Ⅱ期結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期結腸癌患者腸黏膜組織中梭桿菌屬豐度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床分期的結腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結構差異

2.3 不同淋巴結轉移情況的結腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結構差異

門水平：有淋巴結轉移結腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門豐度顯著低于無淋巴結轉移結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移結腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門豐度顯著高于無淋巴結轉移結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。屬水平：有淋巴結轉移結腸癌患者腸黏膜組織中真桿菌屬豐度顯著低于無淋巴結轉移結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移結腸癌患者腸黏膜組織中梭桿菌屬豐度顯著高于無淋巴結轉移結腸癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同淋巴結轉移情況的結腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結構差異

2.4 spearman相關性分析

結腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門、梭桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)；結腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門、真桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結轉移呈負相關(P<0.05)(表4)。

表4 結腸癌患者腸黏膜組織定植菌與臨床分期、淋巴結轉移的相關性

3 討論

結腸癌早期通常表現(xiàn)為消化不良、腹脹、排便習慣改變等無特異性的癥狀，隨著病情進一步發(fā)展可出現(xiàn)肺、腦、肝、骨等組織臟器轉移，出現(xiàn)腸梗阻、淋巴結腫大、肺水腫、黃疸、腹腔積液等轉移征象，危及患者生命。現(xiàn)階段臨床治療結腸癌主要采用手術為主、放化療為輔的綜合性治療方案，能夠緩解臨床癥狀，縮小原發(fā)癌灶，降低臨床分期，提高生存率，但因結腸解剖關系復雜，手術不能徹底切除，癌細胞可向腹腔內種植，沿腸壁浸潤、擴散，沿手術切口面轉移，患者往往預后不良。因此探討結腸癌發(fā)病機制對提升患者預后有重要意義。

結腸癌發(fā)病是一個多步驟、多因素、多途徑的過程，涉及分子遺傳學改變和組織形態(tài)學變化，家族史、潰瘍性結腸炎、結腸息肉、高脂肪飲食、低纖維素飲食等均為結腸癌的高危因素[4]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，宏基因組學的深入研究，二代測序技術的廣泛應用，腸道定植菌群在結腸癌發(fā)病過程中的作用成為近年來臨床的研究熱點。腸道定植菌群是腸道內的正常菌群，定植于腸道黏膜上，與機體生理代謝、腸道穩(wěn)態(tài)、腸黏膜免疫調節(jié)關聯(lián)密切。腸道定植菌群在生理狀態(tài)下處于動態(tài)平衡，當這種平衡遭到打破，腸道定植菌群結構發(fā)生改變，腸黏膜免疫調節(jié)紊亂，腸道屏障功能出現(xiàn)異常，導致組織惡變[5]。厚壁菌門是人體健康狀態(tài)下腸道內的專性厭氧菌，對維持宿主健康發(fā)揮著十分重要的作用[6]。丁酸鹽產生菌是一類腸道內可發(fā)酵產生大量短鏈脂肪酸的細菌，能夠維持腸上皮細胞完整性，保護宿主腸壁，調節(jié)腸道免疫應答，為腸道提供能量，減少DNA氧化損傷，降低腸道炎癥，減弱致癌酶活性，抑制腫瘤形成。真桿菌屬是目前已知的丁酸鹽產生菌之一，被認為是有益菌[7]。梭桿菌屬是一種革蘭陰性專性厭氧菌，具有侵襲、粘附、促炎癥發(fā)生的作用，與炎性腸病發(fā)病有關[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]梭桿菌屬能夠通過E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和β-連環(huán)素(β-catenin)信號促進結直腸癌發(fā)病。變形菌門是細菌中最大的一門，其中γ-變形菌綱包含了很多重要的條件致病菌，可引起腸道微環(huán)境改變，導致腸道定植菌群整體結構失衡[10]。本研究顯示病例組患者腸黏膜組織中厚壁菌門、真桿菌屬豐度顯著低于對照組，病例組患者腸黏膜組織中變形菌門、梭桿菌屬豐度顯著高于對照組，提示結腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結構發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)了有益菌減少、有害菌增加的腸道定植菌群結構失調現(xiàn)象，這與既往研究報道一致[3]，我們推測腸道定植菌群失調可能是誘發(fā)結腸癌的因素之一。本研究顯示結腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門、梭桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結轉移呈正相關，結腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門、真桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結轉移呈負相關，提示腸道定植菌群失調可能是導致結腸癌病情進展的間接原因。

綜上所述，結腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結構發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)了有益菌減少、有害菌增加的腸道定植菌群結構失調現(xiàn)象，且這種失調現(xiàn)象隨著結腸癌病情程度的增加而加重，腸道黏膜菌群結構鑒定有望成為結腸癌高風險人群篩查的途徑之一，調節(jié)腸道菌群有望成為防治結腸癌的新方法。鑒于本研究納入病例數(shù)較少，研究時間較短，未對患者性別、年齡、種族、長期飲食習慣等臨床資料進一步分析，因此有待進一步研究，更加確切了解腸道定植菌群在結腸癌發(fā)生及進展過程中的作用機制，為結腸癌的診斷、治療提供更為有力的證據(jù)。