李忠秋，劉春龍，吳賽輝，張冬杰，王文濤，何鑫淼，田 明，亓美玉，何海娟，劉 娣*

（1.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧研究所，農業(yè)農村部種養(yǎng)結合重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150086；2.中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150081）

肌纖維是骨骼肌的基本結構單位，肌纖維類型的不同具有不同的代謝特征，根據肌纖維中肌球蛋白重鏈（Myosin Hevay Chain，MyHC）亞型的不同，將肌纖維分為MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIx 和MyHC IIb 4種類型，I 型屬于慢速氧化型，IIa 型屬于快速氧化型，IIb 型屬于快速酵解型，IIx 型屬于中間型，代謝特征介于IIa 型和IIb 型之間，氧化代謝能力按照I 型、IIa型、IIx 型、IIb 型依次降低型。骨骼肌能量代謝主要包括有氧代謝和無氧酵解，琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）和蘋果酸脫氫酶（Malate Dehy drogenase，MDH）可代表肌肉的氧化代謝能力，乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）的活性可反映細胞內糖酵解的水平。研究發(fā)現，耐力訓練的運動員肌肉中慢型肌含量增多，SDH 活性顯著提高；在測定大鼠膈肌中不同種肌纖維類型SDH 的活性時發(fā)現，SDH 活性在I 型和IIa 型肌纖維中較高；在檢測人骨骼肌纖維SDH 活性時，發(fā)現SDH 活性在I 型最高，IIa型次之，IIb 型活性最低。在檢測兔膈肌肌纖維亞型和代謝酶活性時，發(fā)現MDH 活性增強與增加兔膈肌I型肌球蛋白的表達一致。在研究不同牛種肌纖維類型與酶活性差異時，發(fā)現MDH 活性與I 型肌纖維比例呈正相關。在比較研究豚鼠的各種肌肉中LDH 的活性時發(fā)現，比目魚?。↖ 型纖維含量較多）LDH 活性最低，白半膜肌和白股?。↖Ib 型纖維含量較多）LDH 活性最高，紅股?。↖Ia 型纖維含量較多）LDH 活性居中。

我國地方豬種的肌纖維類型組成與引進商品豬種的肌纖維類型組成相比，地方豬種氧化型纖維含量較高，而酵解型纖維含量較低，如萊蕪豬與杜洛克豬相比，萊蕪豬氧化型纖維含量顯著高于杜洛克豬；成華豬、巴馬香豬、梅山豬、金華豬、二花臉豬與大白豬相比，其氧化型纖維含量均顯著高于大白豬。民豬是我國優(yōu)秀的地方品種，具有地方豬品種的優(yōu)良特性，氧化型纖維含量較高；大白豬是典型的引進品種，酵解型纖維含量較高，而民豬與大白豬能量代謝關鍵酶活性的研究較少，本實驗在檢測民豬和大白豬肌纖維類型組成差異的基礎上，采用比色法對民豬和大白豬骨骼肌能量代謝關鍵酶類活性進行研究，從骨骼肌能量代謝水平分析民豬和大白豬肌纖維類型組成差異的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 在黑龍江省農業(yè)科學院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖基地，選擇民豬和大白豬各6 頭，體重95 kg 左右，公母各半，公豬已閹割。屠宰前，禁食24 h，不禁水。屠宰后迅速取1 g 左右背最長肌樣品（在第13、14 肋間），放入凍存管，投入液氮，帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆?，用于肌纖維類型和酶活性檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌纖維類型組成測定

1.2.1.1 總RNA 的提取和cDNA 合成 總RNA 的提取按照TRLzol（AMBION）說明進行，總RNA 的完整性檢測使用瓊脂糖凝膠電泳法，總RNA OD 值測定應用分光光度計法，總RNA 濃度通過計算調整為1 μg/μL，分裝，儲存于-80℃冰箱中備用。

cDNA 合成按照cDNA 合成試劑盒（All-in-one First Strand cDNA Synthesis Kit,SEVEN）說明書要求進行。合成體系為20 μL：RNA 6 μL、5×Master Mix 4 μL、DEPC-ddHO 10 μL。反應條件為42℃15 min，短暫離心，冰上冷卻，-20℃冰箱保存。

1.2.1.2 引物的設計和合成 參照Park 等設計合成和引物用于熒光定量PCR，內參為，引物序列及擴增片段長度見表1。

表1 引物信息

1.2.1.3 熒光定量PCR 按照熒光定量PCR 試劑盒（2×SYBR Green qPCR MasterMix,SEVEN）進行熒光定量反應，反應體系20 μL：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（0.25 μmol/L）各0.5 μL，cDNA（0.2 μmol/L）0.5 μL，ddHO 8.5 μL。反應程序為：95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，40 個循環(huán)；每個樣品3 個重復。以內參基因進行校正，目的基因的相對表達量采用2的方法來計算。

1.2.2 能量代謝關鍵酶類活性測定

1.2.2.1 蛋白定量測定 按照蛋白濃度測定試劑盒（南京建成蛋白定量試劑盒）說明書進行樣品蛋白濃度測定。按照操作表2 進行操作。計算公式：待測樣本蛋白濃度（g/L）=（測定OD 值-空白OD 值）/標準OD 值-空白OD 值）×標準品濃度（0.563 g/L）。

表2 操作表格

1.2.2.2 SDH 測定 按照南京建成琥珀酸脫氫酶（SDH）測試盒說明進行樣品中SDH 活性檢測。計算公式為：SDH 活性（U/mgprot）=（ΔA 值÷0.01/ 反應時間（1 min））/（取樣量（0.1 mL）× 待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL））。

1.2.2.3 MDH 測定 按照南京建成蘋果酸脫氫酶（MDH）測試盒說明進行樣品中MDH 活性檢測。計算公式為：MDH 活性（U/mgprot）=（測定ΔA-空白ΔA）/6.2*×比色光徑（0.5 cm））×（反映液總體積（1.05 mL）/取樣量（0.05 mL））× 樣本測試前稀釋稀釋÷ 待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL），其中，6.2*為底物的微摩爾消光系數。

1.2.2.4 LDH 測定 按照南京建成乳酸脫氫酶（LDH）測試盒說明進行樣品中LDH 活性檢測。按照操作表3 進行操作。計算公式為：LDH 活性（U/gprot）=（測定OD 值-對照OD 值）/（標準OD 值-空白OD 紙）× 標準品濃度（2 mmol/L）÷ 勻漿蛋白濃度（gprot/mL）。

表3 操作表格

1.3 數據分析 實驗中獲得的數據應用SPSSV 17.0 軟件的One-Way ANOVA 或T-Test 進行計算和統計分析，結果均采用“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 肌纖維類型組成測定結果 民豬和大白豬4 種肌球蛋白重鏈檢測情況見圖1。民豬I 型、IIa 型和IIx 型mRNA 表達量均顯著高于大白豬，分別是大白豬的1.56、1.73、1.63 倍；而IIb 型mRNA 表達量顯著低于大白豬，是大白豬的0.4 倍。結果表明，民豬氧化型和中間型纖維含量高于大白豬，而酵解型纖維含量低于大白豬。

圖1 民豬和大白豬MyHC 亞型mRNA 表達差異

2.2 民豬與大白豬能量代謝關鍵酶活性測定結果 民豬與大白豬SDH、MDH 和LDH 酶活情況見圖2，民豬SDH 和MDH 活性顯著高于大白豬，分別是大白豬的1.33 倍和1.21 倍；LDH 活性顯著低于大白豬，是大白豬的0.88 倍。結果表明，民豬有氧代謝關鍵酶活性高于大白豬，無氧代謝關鍵酶活性低于大白豬。

圖2 民豬與大白豬SDH、MDH 和LDH 活性差異

3 討 論

骨骼肌承載著收縮運動、能量轉化、物質代謝、結構支撐等核心作用。骨骼肌占哺乳類動物機體組成的40%～50%，并調節(jié)全身的能量代謝穩(wěn)態(tài)。在同一條件下，肌肉處于何種代謝類型與肌肉的自身狀況密切相關，肌肉代謝需要各種酶的參與，代謝酶活性的高低直接影響肌肉代謝狀況，肌肉中的SDH、MDH 和LDH活性能在一定程度上反映肌肉代謝特征。SDH 和MDH 可代表肌肉的氧化代謝能力，LDH 的活性可反映細胞內無氧糖酵解的水平。肌纖維類型組成影響骨骼肌的能量代謝，與相關代謝酶活性密切相關，I 型具有較高的氧化代謝能力，糖酵解能力較低，其代謝酶中的SDH 和MDH 活性較高。IIb 型糖酵解能力高，糖酵解酶LDH 活性很高，有氧代謝酶活性低。IIx 型代謝特征與IIb 型接近，但氧化代謝程度高于IIb 型。IIa 型代謝特征介于IIx 和I 型之間。在牛肉中，SDH 和MDH活性與肌纖維直徑負相關，MDH 活性與I 型含量呈正相關，LDH 活性與IIb 型含量呈正相關，并與牛肉的肉質性狀息息相關，SDH、MDH 活性與屠宰后24 h肌肉pH（pH）顯著正相關，MDH 活性對肌內脂肪沉積具有積極作用，LDH 活性與pH呈顯著負相關，LDH 活性更高時其pH更低，表明LDH 活性與牛肉的酵解能力呈正相關。在豬肉中，氧化型肌纖維表達量高的豬肉其MDH 活性也高，MDH 活性與其肌內脂肪含量具有相關性，MDH mRNA 基因表達與豬肉中肌內脂肪含量關系密切，提高仔豬豬肉MDH 活性可提高其肌內脂肪的沉積，在肌內脂肪含量較高的豬肉中MDH 活性顯著高于肌內脂肪低的豬肉，在豬背最長肌中LDH 活性越高時pH越低，SDH 活性更高時其pH也更高。民豬是典型的脂肪型豬種，肌內脂肪含量高達5.39%，顯著高于大白豬，背最長肌pH為5.63，顯著高于長白豬。豬肉中肌內脂肪含量主要由肌纖維類型組成決定，I 型與肌內脂肪含量呈正相關，IIb 型與肌內脂肪含量呈負相關；肌肉中IIb型含量直接影響屠宰后豬肉中pH 值下降的速度，IIb型含量越高，pH 值下降越快，pH越低，影響豬肉的品質，甚至產生PSE 肉。本研究中民豬氧化型纖維I 型和IIa 型含量顯著高于大白豬，酵解型纖維IIb 型含量顯著低于大白豬，氧化代謝酶SDH 和MDH 活性顯著高于大白豬，糖酵解酶LDH 活性顯著低于大白豬。民豬背最長肌中較高的有氧代謝關鍵酶活性高可能與氧化型肌纖維含量高有關。

4 結 論

肌纖維類型組成對骨骼肌代謝酶活性有顯著影響，民豬氧化型肌纖維I 型和IIa 型含量顯著高于長白豬，酵解型纖維IIb 型含量顯著低于大白豬。這是民豬SDH和MDH 活性顯著高于大白豬、LDH 活性顯著低于大白豬的內在因素。