張豪，鐘亞東，謝明勇

（南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047）

不消化性多糖廣泛存在于食物中，不能被人體消化酶降解，進入結(jié)腸后，在豐富的腸道微生物碳水化合物活性酶的作用下，糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生小分子的低聚糖或單糖，同時產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFAs）、乳酸等有益代謝產(chǎn)物[1-3]。腸道是人體最大的免疫器官，腸上皮細胞具有攝取免疫球蛋白、分泌細胞因子、提呈抗原等免疫功能，與腸組織中的突觸細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等共同構(gòu)建腸道免疫系統(tǒng)[4-5]。研究表明，多糖的結(jié)腸發(fā)酵引起的腸道微生物和SCFAs 的組成、濃度變化會影響著腸道的上皮功能和免疫調(diào)節(jié)能力[6-7]。

近年來，多糖的腸道免疫調(diào)節(jié)功能活性相關(guān)研究較多，例如，茯苓多糖能抑制高脂飲食下腸道巨噬細胞的凋亡，從而保護腸道屏障的完整性[8]。枸杞果實多糖能夠修復腸道屏障來發(fā)揮抗糖尿病效果[9]。桑葉多糖能夠改善小鼠受損的腸道屏障，通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成和SCFAs 的產(chǎn)生來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[10]。大量研究表明不消化性葡聚糖（indigestible glucans，IGs）具有促進腸道益生菌的生長、改善腸道內(nèi)環(huán)境，增強腸道免疫調(diào)節(jié)能力等作用[11-12]。然而，關(guān)于IGs 在結(jié)腸中的酵解產(chǎn)物對腸道免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究較少。多糖的體外腸道菌酵解是分析多糖在人體腸道中降解和活性作用的重要方法，同時為研究多糖的腸道酵解與人體免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系提供了可靠方向。本研究以RAW 264.7巨噬細胞為研究對象，以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）為陽性對照，探討大麥β-葡聚糖（barley βglucan，BG）、海帶多糖（laminarin，L）、酵母β-葡聚糖（yeast β-glucan，BY）、茯苓多糖（pachyman，PAC）、抗性淀粉（resistant starch，R）和聚葡萄糖（litesse，Lit）體外酵解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性，以期為不消化性葡聚糖的腸道免疫研究和功能食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂多糖：美國Sigma-Aldrich 公司；小鼠巨噬細胞系RAW 264.7：中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；胎牛血清：以色列Biological Industries 公司；達爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（含雙抗）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）：北京索萊寶科技有限公司；多粘菌素B、一氧化氮檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒：美國GlpBio 公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒：江蘇酶免實業(yè)有限公司。

試驗中所用IGs 的詳細信息[13]如表1所示。

表1 IGs 的基本信息Table 1 Detail information of IGs

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan LUX 多功能酶標儀（微孔板檢測儀）、CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific 公司；3k15 通用臺式冷凍離心機：美國Sigma 公司；CKX41 倒置顯微鏡：日本Olympus 公司；CytoFLEXS 流式細胞儀：美國Beckman Coulter 公司；FE28-Standard 酸堿度測試儀（pH 計）：美國Mettler toledo 公司；7890 B 氣相色譜儀：美國Agilent 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糞菌制備

新鮮的糞便樣品取自3 位健康志愿者（2 女1 男，22～25 歲，無腸道疾病史），在厭氧手套箱內(nèi)用含有0.1%的L-半胱氨酸鹽酸鹽的PBS 緩沖液以1 ∶10（g/mL）比例進行稀釋勻漿，經(jīng)100 μm 細胞過濾器過濾，得到的過濾液用于接種。

1.3.2 體外酵解及產(chǎn)物處理

體外酵解的培養(yǎng)基參考Hughes 等[14]的方法配制。將BG、BY、L、PAC、R 和Lit 6 種IGs 分別以10%的質(zhì)量分數(shù)溶于培養(yǎng)基中，另設(shè)置無碳水化合物添加的培養(yǎng)基為空白對照組（control，C），分裝至亨蓋特厭氧管中并滅菌。體外酵解時，制備的糞便菌液以10%的體積分數(shù)接種到厭氧管內(nèi)培養(yǎng)基中，使每管培養(yǎng)基終體積為10 mL，厭氧酵解24 h（37 ℃，150 r/min），在0、24 h 時收集酵解液，離心15 min（4 ℃，13 000 r/min），取上清液經(jīng)0.22 μm 無菌濾膜過濾除菌后置于-80 ℃保存。

1.3.3 pH 值和SCFAs 含量測定

取適量酵解液測定其pH 值。將酵解液離心15 min（4 ℃，13 000 r/min），所得上清液過0.22 μm 水系濾頭。取0.6 mL 過膜后上清液加入0.2 mL 的10%硫酸渦旋1 min 酸化，0.4 mL 乙醚渦旋混勻，靜止2 min 后離心2 min（4 ℃，13 000 r/min），吸取乙醚層過0.22 μm 有機濾膜后經(jīng)氣相色譜儀檢測。

采用火焰離子化檢測器；色譜柱為熔融石英毛細管柱HP-FFAP；色譜條件設(shè)置參考文獻[15]。

1.3.4 CCK-8 測定細胞活力

將細胞以1×105個/mL 的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中過夜培養(yǎng)后棄去舊培養(yǎng)基。設(shè)置正常組、陰性對照組、陽性組與樣品組。正常組加入100 μL 含有10% PBS 的完全培養(yǎng)基，陽性組加入100 μL 含有1 μg/mL LPS（溶劑為PBS，以10%的體積比加入）的完全培養(yǎng)基，樣品組加入100 μL 含有不同濃度的IGs 或IGs 酵解液的完全培養(yǎng)基，IGs 的終濃度為0、25、50、100、200、400 μg/mL（以完全培養(yǎng)基溶解和稀釋），IGs 酵解液的終濃度為0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μL/mL（以PBS 稀釋后按體積分數(shù)10%加入完全培養(yǎng)基中），陰性對照組只含有培養(yǎng)基、不含細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去舊培養(yǎng)基，所有孔均加入100 μL 含有10% CCK-8 溶液的培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)1 h后，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度。細胞活力計算公式如下。

式中：C為巨噬細胞的細胞活力，%；A0為陰性對照組的吸光度；A1為樣品組或陽性組吸光度；A2為正常組吸光度。

1.3.5 一氧化氮釋放測定

RAW 264.7巨噬細胞的接種培養(yǎng)、分組和給藥方式與1.3.4 相同，給藥24 h 后收集細胞培養(yǎng)液，按照一氧化氮（nitric oxide，NO）測定試劑盒說明書進行測定。

1.3.6 流式細胞儀檢測活性氧含量

將RAW 264.7巨噬細胞以5 個/mL 的細胞密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL 培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中過夜培養(yǎng)后棄去舊培養(yǎng)基。根據(jù)分組，正常組加入2 mL 含有10% PBS 的完全培養(yǎng)基，LPS 組加入2 mL 含有1 μg/mL LPS 的完全培養(yǎng)基，樣品組加入2 mL 含有不同濃度酵解液的完全培養(yǎng)基，酵解液的終濃度為1、10、100 μL/mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS 沖洗，加入含有10 μmol/L 2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）的無血清培養(yǎng)基（按照1 ∶1 000的體積比用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋DCFHDA，得到終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA），在37 ℃避光孵育30 min，然后除去培養(yǎng)基，避光用PBS 洗兩遍，細胞刮刀收集細胞，離心（1 000×g、5 min），以500 μL PBS 重懸細胞，流式細胞儀測定熒光強度，在Treestar FlowJo 10.6.2 軟件中進行活性氧（reactive oxygen species，ROS）數(shù)據(jù)分析。

1.3.7 細胞因子檢測

RAW 264.7巨噬細胞的接種培養(yǎng)、分組和給藥方式與1.3.6 相同，給藥培養(yǎng)24 h 后收集細胞培養(yǎng)液，按照小鼠TNF-α 試劑盒說明書進行測定。

1.3.8 內(nèi)毒素分析

設(shè)置BG 酵解液組（終濃度為1 μL/mL）和LPS 處理組（終濃度為1 μg/mL），兩組分別加入多粘菌素B（polymyxin B，PMB，100 μg/mL） 預處理24 h。RAW 264.7巨噬細胞的接種培養(yǎng)和給藥方式與1.3.4 相同，給藥24 h 后收集細胞培養(yǎng)液進行TNF-α 測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Graphpad prism 7.0 對試驗結(jié)果進行作圖分析。應用mintab 19.0 統(tǒng)計軟件對各組試驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)性分布的多組數(shù)據(jù)間進行單因素方差分析（ANOVA）和Tukey 多重比較檢驗評估不同組間的差異，當P<0.05 時，認為其具有顯著性差異。

2 結(jié)果分析

2.1 IGs 對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響

細胞活力的測定是評價藥物對細胞生長影響作用的一種常用方法[16]，通過對樣品處理后的巨噬細胞活性的檢測可以評價樣品的毒性和免疫增強能力。IGs 對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響如圖1所示。

圖1 IGs 對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響Fig.1 Effect of IGs on viability of RAW 264.7 macrophages

由圖1 可知，在0～400 μg/mL 的濃度范圍6 種IGs對RAW 264.7巨噬細胞處理后，相比于0 μg/mL 的正常組，細胞活力沒有顯著性地降低，而且除R 外，BG 的400 μg/mL、L 的100～400 μg/mL、BY 的25～400 μg/mL、Lit 的20～50 μg/mL 和200～400 μg/mL 以及PAC 的25～200 μg/mL 對RAW 264.7巨噬細胞活力有顯著性地提高作用（P<0.05）。表明6 種IGs 在濃度為0～400 μg/mL時，對RAW 264.7巨噬細胞沒有毒性作用。

2.2 IGs 酵解液的pH 值和總SCFAs 含量測定

多糖在腸道中酵解產(chǎn)生大量SCFAs，如乙酸、丙酸和丁酸等，是腸道酵解的重要代謝產(chǎn)物[17]。IGs 酵解液的pH 值和總SCFAs 含量測定結(jié)果如圖2所示。

圖2 IGs 體外酵解24 h 的pH 值變化和總SCFAs 含量Fig.2 pH change and total SCFA concentration in IGs fermented for 24 h in vitro

在本試驗中總SCFAs 含量為乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸含量之和。由圖2 可知，經(jīng)過24 h的體外酵解，6 種IGs 均顯著性地降低了反應體系的pH 值（P<0.05），表明酵解過程中產(chǎn)生了大量的酸性物質(zhì)。與空白對照組相比，6 種IGs 的酵解均顯著提高了總SCFAs 的含量（P<0.05），其中L 產(chǎn)量最高，此外由高到低依次是BG、BY、Lit、R 和PAC，其中，BY、Lit 和R 的產(chǎn)量之間沒有顯著性差異（P>0.05）。IGs 的體外酵解過程中SCFAs 的產(chǎn)生與它們的理化性質(zhì)有關(guān)，水溶性越高、糖鏈結(jié)構(gòu)越簡單的IGs 的酵解速率越大，SCFAs 產(chǎn)量越高[18-19]。

2.3 IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響

IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響如圖3所示。

圖3 IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞活力的影響Fig.3 Effect of IG fermentation broths on viability of RAW 264.7 macrophages

由圖3 可知，與正常組相比，0、24 h 的IGs 酵解液在0.03～100 μL/mL 時不同程度地提高了RAW 264.7巨噬細胞活力，且在一定范圍內(nèi)巨噬細胞活力與酵解液濃度呈依賴性增加。

當酵解0 h 時，BG、L、BY、PAC 酵解液對細胞活力的最佳作用濃度與空白對照組一致，為100 μL/mL，R 和Lit 則為30 μL/mL。酵解24 h 時，IGs 酵解液和空白對照組的最佳作用濃度均比0 h 酵解液組低，添加量較低時即出現(xiàn)活力抑制的現(xiàn)象。其中，前者為0.3～30 μL/mL，后者為10～30 μL/mL。由此可知，體外酵解提高了IGs 對細胞活力的促進效果，且IGs 酵解液效果比空白對照組更優(yōu)。

各24 h 組在更高濃度（例如BG 酵解液30～100 μL/mL）作用時，其細胞活力均呈現(xiàn)下降趨勢。這些變化可能是由于24 h 酵解液中含有大量的SCFAs 和多糖碎片，且這些代謝物在各組中的含量有所差異，在低添加量時顯著促進細胞的增殖活性，而提高酵解液添加量時，SCFAs 含量增大、pH 值過低而抑制了RAW 264.7巨噬細胞的正常生長[20]。

2.4 IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞釋放NO 的影響

NO 的產(chǎn)生是巨噬細胞受到刺激活化的重要特征之一，與細胞的炎癥反應緊密相關(guān)[21]。通過對0 h 和24 h 各IGs 酵解液組的細胞NO 釋放量進行測定，分析各組IGs 在不同添加量下對細胞炎癥反應的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞釋放NO 的影響Fig.4 Effect of IG fermentation broths on NO release from RAW 264.7 macrophages

由圖4 可知，與正常組相比，酵解0 h 的各組與酵解24 h 的空白對照組在各劑量下對NO 釋放量均無顯著影響，而24 h 的IGs 酵解液劑量為0.3～100 μL/mL時不同程度地促進了NO 的釋放，表明IGs 在酵解24 h后能促進巨噬細胞的炎癥反應。其中，對于酵解24 h的IGs 酵解液，BG 組在3～30 μL/mL，R 組和L 組在1～10 μL/mL，BY、PAC 組在10～100 μL/mL 時、Lit 組在3～100 μL/mL，作用效果較強，且顯著高于正常組（P<0.05）。

與細胞活力測定結(jié)果相似，當劑量進一步提高時，各IGs 酵解24 h 組NO 釋放量開始不同程度地下降，這可能是高濃度發(fā)酵液的pH 值過低，導致細胞生長紊亂。另外，根據(jù)對RAW 264.7巨噬細胞活力和NO 釋放量的測定，確定了后續(xù)試驗所用24 h IG 酵解液的低、中、高劑量分別為1、10、100 μL/mL，并按照此濃度進行其他指標測定。

2.5 IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞ROS 生成的影響

ROS 是需氧細胞在生長過程中氧化反應的一類代謝產(chǎn)物，同時是重要的信號分子，參與維持細胞正常的生理機能[22]。本研究使用流式細胞術(shù)進行測定分析，DCFH-DA 熒光探針被細胞內(nèi)ROS 氧化為DCF，產(chǎn)生綠色熒光，DCF 熒光強度越強，則細胞內(nèi)ROS 含量越高。IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞ROS 生成的影響如圖5所示。

圖5 IGs 的24 h 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞ROS 生成的影響Fig.5 Effect of 24 h fermentation broths of IGs on ROS production from RAW 264.7 macrophages

圖5 表明，相比于正常組，BG、R、Lit 和L 組的各濃度均能夠顯著性地促進細胞ROS 的產(chǎn)生（P<0.05），且前三者呈濃度依賴性增加，而L 酵解液劑量為10 μL/mL時ROS 的產(chǎn)量最高。BY 和PAC 酵解液劑量為10、100 μL/mL 時，能夠顯著性地促進細胞ROS 的產(chǎn)生（P<0.05），且在100 μL/mL 時，PAC 組的ROS 產(chǎn)量遠高于其余IGs 組。表明各組IGs 酵解液均具有刺激細胞生成ROS 的能力，其能力的差異可能與酵解產(chǎn)物的組成有關(guān)。

2.6 IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響

細胞因子是機體細胞和體液免疫反應過程中重要的信號分子，巨噬細胞被激活后能夠產(chǎn)生大量的細胞因子，如γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白介素-4（interleukin，IL-4）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）等，參與免疫功能的調(diào)控[23]。TNF-α 是機體重要的炎癥介質(zhì)，由巨噬細胞和淋巴細胞分泌，參與人體的炎癥反應和免疫反應。IGs 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞釋放TNFα 的影響如圖6所示。

圖6 IGs 的24 h 酵解液對RAW 264.7巨噬細胞釋放TNF-α 的影響Fig.6 Effect of 24 h fermentation broths of IGs on TNF-α release from RAW 264.7 macrophages

由圖6 可知，與正常組相比，除100 μL/mL 的BY酵解液對TNF-α 沒有顯著影響外，各IG 酵解液在各濃度均顯著性地提高了TNF-α 釋放量（P<0.05）。表明各IG 酵解液均能顯著性地激活巨噬細胞，使其TNFα 的分泌量提高。

2.7 酵解液中內(nèi)毒素的影響分析

PMB 是一種s能與LPS 特異性結(jié)合的抗生素，使LPS 不能誘導巨噬細胞活化為M 1 型，抑制LPS 對巨噬細胞的促炎作用[24]。IGs 的腸道菌體外發(fā)酵液上清中可能含有細菌LPS，在本試驗中以BG 酵解液為例，使用PMB 預處理來排除酵解液中LPS 的作用。已知1 μg/mL 的LPS 和1 μL/mL 的BG 酵解液給藥處理對巨噬細胞TNF-α 分泌的作用效果相似，對LPS 和BG酵解液組同時進行PMB 預處理，結(jié)果如圖7所示。

圖7 PMB 預處理對巨噬細胞TNF-α 釋放量的影響Fig.7 Effect of PMB pretreatment on TNF-α release from macrophages

由圖7 可知，經(jīng)PMB 處理后，LPS 組的TNF-α 釋放量顯著性下降（P<0.05），而BG 組變化不顯著，表明IGs 的24 h 酵解液促進RAW 264.7巨噬細胞炎癥反應表達的主要成分是其他酵解產(chǎn)物而不是來自腸道菌裂解的LPS。

3 結(jié)論

以RAW 264.7巨噬細胞為研究對象，分析IGs 體外腸道菌酵解液的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，6 種IGs對細胞沒有毒性作用，在腸道菌的酵解過程中產(chǎn)生了大量的SCFAs。IGs 的24 h 發(fā)酵液都顯著提高了細胞免疫調(diào)節(jié)活性，能夠提高RAW 264.7巨噬細胞的細胞活力，促進細胞NO 的釋放、ROS 的產(chǎn)生和TNF-α 的分泌。此外，PMB 的處理結(jié)果表明，IGs 的酵解產(chǎn)物而不是腸道菌結(jié)構(gòu)成分LPS 促進了巨噬細胞的TNF-α 的分泌。本研究為IGs 在腸道酵解的免疫調(diào)節(jié)研究提供理論參考，同時為IGs 的相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。