唐 毓，楊鎰峰，張 穎，王 巖，薛海龍，許保增

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112）

生殖技術(shù)在任何物種中的廣泛應(yīng)用都離不開配子和胚胎的超低溫保存，而卵母細(xì)胞的冷凍保存效率直接決定著人類輔助生殖以及動(dòng)物生殖研究領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)程。人們對(duì)于卵母細(xì)胞冷凍保存的研究至今已有四十多年的歷史，目前常用于卵母細(xì)胞冷凍保存的方法主要有傳統(tǒng)的慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。而玻璃化冷凍法是公認(rèn)的冷凍保存卵母細(xì)胞最安全、最有效的方法，現(xiàn)已被成功應(yīng)用于人類、兔、牛、羊等卵母細(xì)胞的冷凍保存。豬卵母細(xì)胞的超低溫保存具有重要的農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)意義。豬是我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)，其卵母細(xì)胞的冷凍保存可有效降低優(yōu)良品種遺傳資源的維護(hù)成本，防止因感染、疾病、遺傳漂變?cè)斐傻膿p失，加快良種繁育進(jìn)程。此外，豬作為人類生殖醫(yī)學(xué)研究重要的動(dòng)物模型，在生理和免疫學(xué)上與人類有許多相似之處，豬卵母細(xì)胞的高效保存可以為人類提供大量的活卵母細(xì)胞來測(cè)試相關(guān)技術(shù)的安全性。與牛、羊等大家畜相比，豬卵母細(xì)胞的特點(diǎn)是胞漿內(nèi)脂質(zhì)含量相對(duì)較高，這些脂滴在冷卻和升溫過程中經(jīng)常會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)線粒體、膜質(zhì)結(jié)構(gòu)、皮質(zhì)顆粒、紡錘體和細(xì)胞骨架的基本成分（微管和微絲）嚴(yán)重?fù)p傷，這是限制豬卵母細(xì)胞冷凍保存的主要障礙。雖然已有從玻璃化冷凍保存的豬卵母細(xì)胞中獲得活產(chǎn)子代的報(bào)道，但玻璃化冷凍后的豬卵母細(xì)胞存活率低、發(fā)育潛能差的問題始終制約著其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。近幾年，人們對(duì)提高豬卵母細(xì)胞冷凍效率進(jìn)行了大量研究，其中包括冷凍保護(hù)劑（Cryoprotectant，CPA）和冷凍裝置的篩選與開發(fā)，以及降低卵母細(xì)胞脂滴含量、添加抗氧化劑、優(yōu)化細(xì)胞體積調(diào)控減少滲透脅迫損傷等方法，有效提高了玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的存活率和移植后的產(chǎn)仔率。本文對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍保存的常用方法，玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞造成的損傷類型以及針對(duì)不同的冷凍損傷所提出的解決方案進(jìn)行綜述，為提高豬卵母細(xì)胞的冷凍保存效率提供參考依據(jù)。

1 卵母細(xì)胞的冷凍保存方法

1.1 慢速冷凍法 1972 年Whittingham 等首次采用慢速冷凍法保存小鼠胚胎并在解凍后獲得活產(chǎn)子代，隨后，又在1977 年利用慢速冷凍成功冷凍保存小鼠卵母細(xì)胞并獲得后代，自此人們便開啟了哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞冷凍保存的探索之旅。慢速冷凍是通過將卵母細(xì)胞暴露于濃度≤1.5 mol/L 的滲透性冷凍保護(hù)劑和濃度≤0.3 mol/L 的非滲透性冷凍保護(hù)劑中緩慢脫水。在此期間，利用可編程的冷凍設(shè)備將卵母細(xì)胞緩慢降溫（0.3℃/min）至-30℃，之后迅速降溫（50℃/min）至-150℃保存于液氮中。在慢速冷凍過程中，卵母細(xì)胞在15～-4℃范圍內(nèi)最易形成體積較大的冰晶，而形成的冰晶會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞造成許多不可逆的損傷，嚴(yán)重影響解凍后卵母細(xì)胞的存活率以及后期發(fā)育能力。豬卵母細(xì)胞由于脂肪含量高，對(duì)低溫極其敏感，慢速冷凍過程中形成的冰晶會(huì)引起卵母細(xì)胞大量死亡，冷凍保存異常困難，至今還未見采用傳統(tǒng)慢速冷凍技術(shù)冷凍豬卵母細(xì)胞獲得活產(chǎn)仔豬的報(bào)道。此外，慢速冷凍需要可編程的冷凍設(shè)備，冷凍時(shí)間長，冷凍損傷大，這些缺點(diǎn)限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

1.2 玻璃化冷凍法 隨著人們對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存研究的不斷深入，慢速冷凍已經(jīng)無法滿足人們的需求，尋求新的冷凍方法成為人們追求的目標(biāo)。1985 年Rall等首次采用玻璃化冷凍法成功保存小鼠胚胎，該方法可有效減少冰晶生成所引起的機(jī)械性損傷，具有快速、簡便、高效等優(yōu)點(diǎn)。玻璃化冷凍通常是先將卵母細(xì)胞暴露于低濃度的冷凍保護(hù)劑（Cryoprotectant，CPA）中進(jìn)行平衡，在置于冷凍裝置之前快速暴露于高濃度的冷凍保護(hù)劑（≤1 min）中促使卵母細(xì)胞中的液體迅速轉(zhuǎn)變成玻璃狀無定形固體，然后將開放或封閉式的冷凍裝置立即投入液氮中使細(xì)胞迅速降溫（>10 000℃/min）進(jìn)入凝固狀態(tài)，從而減少冷凍過程中冰晶的形成。目前，玻璃化冷凍技術(shù)已成功應(yīng)用在豬卵母細(xì)胞和胚胎保存中，并通過凍融后的豬胚胎和卵母細(xì)胞獲得活產(chǎn)子代。但玻璃化冷凍過程中高濃度的冷凍保護(hù)劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性和滲透脅迫，冷凍后的豬卵母細(xì)胞存活率以及受精后的發(fā)育能力仍然低于其他物種，這些問題導(dǎo)致豬卵母細(xì)胞冷凍難以得到廣泛的商業(yè)化應(yīng)用。因此，深入了解冷凍損傷的類型和機(jī)制，為改善冷凍對(duì)卵母細(xì)胞造成的致命或不可逆?zhèn)μ峁├碚撘罁?jù)，有利于開發(fā)豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法。

2 豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的損傷

冷凍過程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都可能對(duì)卵母細(xì)胞造成損傷，如滲透性保護(hù)劑毒性，冷凍/解凍過程中帶來的滲透壓損傷及冰晶損傷等，以及玻璃化所引起的一系列細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變，例如透明帶過早硬化、減數(shù)分裂紡錘體異常、氧化應(yīng)激以及早期凋亡等，嚴(yán)重制約豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍效率，影響其后期發(fā)育潛能。

2.1 冷凍損傷

2.1.1 滲透性保護(hù)劑毒性 卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍過程中通過具有高滲透性的CPA 穿過細(xì)胞膜產(chǎn)生滲透梯度，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的水外排（脫水），將細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化為無定形狀態(tài)，當(dāng)溫度快速降低時(shí)減少冰晶的形成，降低細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷，同時(shí)利用非滲透性CPA 在冷凍過程中吸收細(xì)胞內(nèi)的游離水。目前，常用于豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的保護(hù)劑包括乙二醇（Ethylene Glycol，EG）、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、丙二醇（Propylene Glycol，PG）等滲透性CPA 和蔗糖（Sucrose）、海藻糖（Trehalose）、聚蔗糖（Ficoll）等非滲透性CPA。長時(shí)間暴露于高濃度的滲透性CPA容易引起細(xì)胞毒性效應(yīng)和滲透性休克。在玻璃化冷凍降溫過程中卵母細(xì)胞在高濃度的DMSO 中室溫作用1 min，解凍培養(yǎng)后會(huì)得到較高的細(xì)胞成熟率，而37℃作用5 min 則會(huì)誘發(fā)卵母細(xì)胞孤雌激活。經(jīng)過多年的研究，EG 是公認(rèn)的卵母細(xì)胞玻璃化冷凍最有效的低毒性CPA，凍融后存活率高，但作用時(shí)間過長或者溫度過高都會(huì)引起卵母細(xì)胞受損，影響玻璃化冷凍效果。豬卵母細(xì)胞是大體積的球型結(jié)構(gòu)，其表面積與體積之比低，因此需要暴露在CPA 中更多的時(shí)間進(jìn)行平衡，從而增加了CPA 毒性對(duì)細(xì)胞的損傷。

2.1.2 細(xì)胞骨架損傷 在平衡過程中，卵母細(xì)胞暴露在高濃度的CPA 中產(chǎn)生滲透壓梯度，引起細(xì)胞內(nèi)外的水交換導(dǎo)致細(xì)胞體積劇烈波動(dòng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞破裂。此外，卵母細(xì)胞在冷凍過程中，突然降低溫度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)對(duì)溫度敏感型的結(jié)構(gòu)造成損傷。GV 期卵母細(xì)胞的透明帶和卵丘細(xì)胞構(gòu)成功能單元，卵丘細(xì)胞絨毛通過透明帶延伸，形成縫隙連接，與卵母細(xì)胞溝通并向卵母細(xì)胞提供成熟所需的營養(yǎng)。在體外受精過程中，卵丘細(xì)胞在促進(jìn)精子獲能和防止多精受精發(fā)揮重要作用。卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍平衡過程中，細(xì)胞脫水而導(dǎo)致透明帶破裂，引起卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的縫隙連接被中斷，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育成熟所需的能量供給。此外，微管相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)微管的組裝并參與其他細(xì)胞成分的相互作用，聚合的微管蛋白與胞質(zhì)中游離的微管蛋白處于平衡狀態(tài)，玻璃化可能觸發(fā)微管蛋白解聚，進(jìn)一步誘導(dǎo)微管的解聚和紡錘體的混亂甚至消失。

2.2 非冷凍損傷

2.2.1 透明帶過早硬化 在卵母細(xì)胞成熟（Meiosis Phase II，MII 期）后，皮質(zhì)顆粒細(xì)胞位于卵質(zhì)膜內(nèi)，在受精時(shí)發(fā)生配子融合后，皮質(zhì)顆粒釋放進(jìn)入卵黃周隙，引起透明帶硬化，為多精受精提供生理屏障。Gook 等發(fā)現(xiàn)冷凍后卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞會(huì)提前釋放到卵周隙中，引起透明帶過早硬化，阻礙精子受精，而冷凍保存的卵母細(xì)胞有近三分之二的顆粒細(xì)胞會(huì)提早釋放，從而影響卵母細(xì)胞的受精發(fā)育能力。

2.2.2 減數(shù)分裂紡錘體異常 減數(shù)分裂不同階段的豬卵母細(xì)胞對(duì)低溫的敏感度存在差異。成熟卵母細(xì)胞微管組裝并形成紡錘體且膜通透性較高，對(duì)低溫極為敏感；未成熟的卵母細(xì)胞微管未形成紡錘體，因此對(duì)冷凍敏感性較低，進(jìn)行玻璃化冷凍可獲得更高比例的囊胚。研究指出豬卵母細(xì)胞暴露在24℃室溫5 min 后紡錘體開始解聚，降溫至4℃時(shí)可加快誘導(dǎo)紡錘體主軸解聚，導(dǎo)致染色體錯(cuò)位或移位。卵母細(xì)胞染色體通過捕獲微管的著絲點(diǎn)沿紡錘體的赤道板排列，以保證受精后染色體的準(zhǔn)確分離，當(dāng)染色體被破壞時(shí)，微管在染色體周圍聚集，無法形成正常的染色體，最終引起受精發(fā)育異常。雖然卵母細(xì)胞紡錘體在復(fù)溫后可以進(jìn)行再組裝，但不同物種的卵母細(xì)胞紡錘體的再組裝程度存在較大差異。豬的卵母細(xì)胞在GV 期的染色質(zhì)仍處于去致密狀態(tài)，未形成微管組織中心，微管系統(tǒng)未形成，但其冷凍后存活率和發(fā)育潛能也會(huì)降低。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中，在低溫保護(hù)劑的作用下紡錘體的結(jié)構(gòu)可能會(huì)被保存下來，但在解凍過程中，紡錘體的結(jié)構(gòu)則會(huì)完全喪失，最終將可能導(dǎo)致染色體異常和非整倍體的發(fā)生。

2.2.3 氧化應(yīng)激與早期凋亡 活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）主要來源于線粒體和膜質(zhì)，生物體處于平衡狀態(tài)的ROS 可以調(diào)節(jié)Ca的平衡和糖代謝穩(wěn)定，并能夠活化和抑制細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)因子。高水平的ROS 會(huì)引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，影響能量代謝，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育潛能降低。玻璃化冷凍過程中，卵母細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平顯著升高，從而造成線粒體損傷，破壞卵母細(xì)胞質(zhì)膜，引起卵母細(xì)胞的DNA 損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，高濃度的ROS會(huì)抑制DNA 修復(fù)酶和抗氧化蛋白酶，使細(xì)胞內(nèi)的DNA產(chǎn)生高突變性，從而損傷卵細(xì)胞的發(fā)育潛能。

2.2.4 表觀遺傳修飾改變 表觀遺傳是指在細(xì)胞分裂過程中，在不改變核苷酸序列的情況下，以可遺傳的方式使遺傳物質(zhì)表達(dá)多樣化的過程。表觀遺傳機(jī)制在哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生中起著重要作用，當(dāng)卵母細(xì)胞進(jìn)入第一次減數(shù)分裂時(shí)，轉(zhuǎn)錄停止，直至受精發(fā)育成胚胎后恢復(fù)轉(zhuǎn)錄。然而，在這個(gè)階段，卵母細(xì)胞基因表達(dá)的變化主要依賴于轉(zhuǎn)錄的翻譯和降解。而合成的蛋白依賴于翻譯后修飾的調(diào)控，如磷酸化、去磷酸化、泛素化、SUMO 化和已有轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以精確調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟過程。此外，研究發(fā)現(xiàn)胚胎中發(fā)生的所有表觀遺傳修飾在很大程度上取決于卵母細(xì)胞中儲(chǔ)存的母源mRNA表達(dá)的表觀遺傳修飾酶的水平。因此，卵母細(xì)胞時(shí)期需要合成和保存減數(shù)分裂完成、受精和卵母細(xì)胞-胚胎轉(zhuǎn)變期間所需的所有轉(zhuǎn)錄本（特別是表觀遺傳修飾酶的表達(dá)）。而卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍過程中發(fā)生任何對(duì)基因組完整性或轉(zhuǎn)錄本合成、抑制和穩(wěn)定性相關(guān)、以及與翻譯機(jī)制相關(guān)的損傷都可能對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)和關(guān)鍵的生物學(xué)事件產(chǎn)生重大影響。玻璃化冷凍對(duì)表觀遺傳修飾的影響發(fā)生在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，直接或間接地影響著染色體的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍會(huì)引起豬卵母細(xì)胞組蛋白H4ac 水平升高，H3K9me 水平下降，導(dǎo)致卵母細(xì)胞染色質(zhì)在受精過程中的表觀遺傳修飾異常，降低玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞發(fā)育能力。此外，玻璃化冷凍還會(huì)引起豬卵母細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)（）下調(diào)，導(dǎo)致凍融后的豬卵母細(xì)胞線粒體分布和功能異常，降低細(xì)胞受精發(fā)育能力。

3 改善豬卵母細(xì)胞冷凍保存的方法

豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍技術(shù)相對(duì)于其他哺乳動(dòng)物仍處于相對(duì)滯后的階段。近年來，人們不斷致力于優(yōu)化豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍方法，開發(fā)新技術(shù)、新途徑用以改善豬卵母細(xì)胞冷凍效率低的困境。目前針對(duì)于卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究主要集中于篩選新類型的CPA以及濃度，開發(fā)新型的冷凍載體，優(yōu)化細(xì)胞體積，以及在冷凍保護(hù)劑中添加抗氧化劑等方面。

3.1 冷凍保護(hù)劑的選擇 CPA 根據(jù)其滲透性分為滲透型和非滲透性兩種，滲透性CPA 與水分子形成氫鍵，可以防止冰晶形成，保護(hù)細(xì)胞不受溶液效應(yīng)的影響。非滲透劑不僅可以在冷凍過程中吸收細(xì)胞內(nèi)的游離水，還可以在解凍升溫過程中吸收細(xì)胞內(nèi)的CPA。然而，高濃度的單個(gè)CPA 對(duì)細(xì)胞是具有毒性作用，而低濃度的單個(gè)CPA 毒性較小，因此，玻璃化方法通常使用2 個(gè)或多個(gè)CPA 的組合，如15%（v/v）EG 和15%（v/v）DMSO或PROH，合并添加0.5 mol/L 蔗糖用于玻璃化冷凍，有助于進(jìn)一步降低CPA 對(duì)卵母細(xì)胞的毒性。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞在解凍過程中去除細(xì)胞內(nèi)CPA 產(chǎn)生的滲透梯度會(huì)引起細(xì)胞大量吸收水分，導(dǎo)致細(xì)胞體積迅速膨脹，造成卵母細(xì)胞致死性損傷。為此，人們通過使用蛋白質(zhì)（人血清白蛋白或血清替代品）或糖（葡萄糖或蔗糖）等的保護(hù)劑，控制CPA 的去除速率，避免細(xì)胞體積驟然變大。開發(fā)新型冷凍保護(hù)劑是提高卵母細(xì)胞冷凍保存效率的有效方法，Mamoshita 等將羧化多聚賴氨酸引入CPA 有效減少了哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎玻璃化冷凍所造成的物理和生理性損傷，冷凍后的豬胚胎囊胚率可提高至19.4%±4.6%，顯著高于未添加組1.3%±1.0%，為進(jìn)一步提高哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎玻璃化冷凍效果提供一種新的CPA。

3.2 保護(hù)細(xì)胞骨架 玻璃化冷凍對(duì)于細(xì)胞骨架的損傷直接影響解凍后卵母細(xì)胞的存活率和后續(xù)發(fā)育能力。近年來，研究證實(shí)多種細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑對(duì)于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的低溫保存具有保護(hù)作用，目前使用最廣泛的包括細(xì)胞松弛素B（Cytochalasin B，CB）和紫杉醇（Paclitaxel，PT）。細(xì)胞松弛素B 是激動(dòng)蛋白聚合的抑制劑，可與F-肌動(dòng)蛋白的正（+）端結(jié)合，阻斷F-肌動(dòng)蛋白的功能，使細(xì)胞更富有彈性，研究證實(shí)其在一定程度上減少玻璃化過程引起的細(xì)胞骨架系統(tǒng)的破壞。玻璃化前使用細(xì)胞松弛素B 處理可降低豬GV 期卵母細(xì)胞微管損傷，維持MII 期正常紡錘體結(jié)構(gòu)，單精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）后更利于囊胚發(fā)育。

紫杉醇具有促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定的作用。因此，在玻璃化過程中添加紫杉醇可有效降低微管的損傷，減少紡錘體異?，F(xiàn)象的發(fā)生。玻璃化前對(duì)豬卵母細(xì)胞進(jìn)行紫杉醇處理，可顯著改善卵母細(xì)胞的孤雌發(fā)育，卵裂率由5.6%提高至24.3%。此外，研究表明，紫杉醇具有促進(jìn)微管蛋白在體外重新組裝的作用，而卵母細(xì)胞的微管細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域線粒體的轉(zhuǎn)移機(jī)制。采用紫杉醇預(yù)處理的卵母細(xì)胞，經(jīng)玻璃化冷凍后可顯著改善卵母細(xì)胞中線粒體的分布情況。

3.3 優(yōu)化冷凍載體 豬卵母細(xì)胞的脂質(zhì)含量高于其他物種，至今還沒有采用傳統(tǒng)慢速冷凍技術(shù)冷凍豬卵母細(xì)胞產(chǎn)活豬的報(bào)道。1998 年Isachenko 等首次將玻璃化冷凍技術(shù)用于豬GV 期卵母細(xì)胞低溫保存，采用0.25 mL麥管作為冷凍載體，冷凍后的卵母細(xì)胞成功在體外發(fā)育至囊胚期。影響玻璃化的一個(gè)重要因素是樣品的體積，樣品越小，需要冷凍的液體就越少，形成冰晶的概率就越低，為提高玻璃化冷凍效率，應(yīng)盡可能地減少冷凍過程中玻璃化液體的體積。目前人們常用的冷凍載體包括開放式拉長麥管（OPS）、冷凍環(huán)（Cryoloop）、金屬塊（SSV）、冷凍葉（Cryoleaf）以及微滴法（Microdroplet）等。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍過程中對(duì)卵母細(xì)胞的潛在毒性隨降溫速率增加而減少，因此改良冷凍載體材質(zhì)與構(gòu)造，對(duì)于提高卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的降溫和升溫速率，降低CPA 的毒性作用具有重要意義。

3.4 降低脂質(zhì)含量 在豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中具有大而豐富的脂滴，隨著胚胎進(jìn)入囊胚期，脂滴的大小和豐度逐漸降低。因此在卵母細(xì)胞冷凍保存過程中，降低溫度會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)脂滴由液相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z相，進(jìn)而導(dǎo)致膜完整性降低，造成細(xì)胞死亡。因此，降低豬卵母細(xì)胞中脂滴的含量是決定其冷凍成功與否的關(guān)鍵，Park 等首次采用離心法使細(xì)胞質(zhì)脂滴極化，再通過顯微操作去除部分脂質(zhì)，有效提高了玻璃化豬卵母細(xì)胞的體外成熟率。但顯微操作去脂過程中極易造成細(xì)胞透明帶損傷，同時(shí)也增加了病原體傳播的可能性；隨后，Spate 等在玻璃化冷凍前采用高滲透離心技術(shù)處理豬胚胎，凍融后獲得了高存活率的豬胚胎。此外，人們嘗試在解凍后進(jìn)行體外成熟的豬卵母細(xì)胞中添加Forskolin（脂解刺激劑），培養(yǎng)42 h 的卵母細(xì)胞存活率比對(duì)照組提高20%，但未顯著提高冷凍后豬卵母細(xì)胞的卵裂率。

3.5 添加有機(jī)滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì) 在玻璃化過程中，通過少量高濃度的CPA 實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的超快速冷凍，研究表明高滲環(huán)境和異常的滲透壓引起細(xì)胞體積的急劇改變。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體積調(diào)節(jié)依賴于細(xì)胞內(nèi)無機(jī)和有機(jī)滲透壓力調(diào)節(jié)小分子的濃度和種類。當(dāng)細(xì)胞正常體積減少時(shí)，細(xì)胞首先激活無機(jī)滲透壓調(diào)節(jié)分子通道（如Na/H離子交換泵），通過提高細(xì)胞內(nèi)無機(jī)鹽離子的濃度而恢復(fù)細(xì)胞體積。然而，高濃度的無機(jī)鹽離子會(huì)影響正常細(xì)胞內(nèi)正負(fù)電荷平衡，此時(shí)，細(xì)胞通過激活不帶電荷的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)小分子通道（如甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子GLYT1）置換無機(jī)滲透分子，從而達(dá)到滲透壓平衡。而當(dāng)細(xì)胞體積增大時(shí)，細(xì)胞激活體積調(diào)控的陰離子通道（Cl），排出無機(jī)陰離子和有機(jī)小分子，降低離子濃度從而恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍保護(hù)劑中添加一些有機(jī)滲透壓調(diào)節(jié)小分子（如甘氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺等）可有效減少卵母細(xì)胞冷凍/解凍時(shí)的滲透壓力，使細(xì)胞體積快速達(dá)到穩(wěn)態(tài)。Cao 等在冷凍過程中添加有機(jī)滲透壓調(diào)節(jié)小分子甘氨酸，通過增強(qiáng)細(xì)胞Na/K泵功能，參與改變細(xì)胞內(nèi)離子分布調(diào)節(jié)滲透壓，有效的減少了冷凍/解凍過程中卵母細(xì)胞的滲透脅迫，提高小鼠卵母細(xì)胞冷凍后的成活率及后續(xù)發(fā)育能力。

3.6 添加抗氧化劑 卵母細(xì)胞在冷凍過程中氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡是造成其凍融后存活力下降的主要因素之一。近年來，人們發(fā)現(xiàn)褪黑激素具有清除細(xì)胞自由基，抑制脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、防止DNA 損傷、降低體內(nèi)過氧化物含量的作用。卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍過程中添加褪黑素可有效提高卵母細(xì)胞的冷凍效率。Zhang 等將褪黑素應(yīng)用于人類卵母細(xì)胞冷凍保存中，發(fā)現(xiàn)通過抑制氧化應(yīng)激和維持卵膜通透性來改善人卵母細(xì)胞的低溫保存效果。而在玻璃化冷凍保護(hù)液中添加10mol/L 褪黑素可顯著降低玻璃化冷凍后牛卵母細(xì)胞的ROS 水平，抑制其細(xì)胞凋亡，從而增加解凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力，但是在豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍過程中還未見使用褪黑素的報(bào)道。此外，人們發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl Cysteine，NAC）是含有硫醇基團(tuán)和半胱氨酸前體的抗氧化劑，被細(xì)胞攝取后用于谷胱甘肽的合成，在玻璃化保護(hù)劑中添加對(duì)羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力具有顯著提升。這些抗氧化劑的研究與開發(fā)為提高豬卵母細(xì)胞的冷凍效率提供更多的可能性。

4 展 望

豬卵母細(xì)胞獨(dú)特的生物學(xué)性狀制約著其玻璃化冷凍保存的發(fā)展進(jìn)程，現(xiàn)有的冷凍保存方案對(duì)豬卵母細(xì)胞的活力和發(fā)育能力仍存在較大損傷，無法滿足人們的需求。隨著對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍損傷研究的不斷深入，在玻璃化冷凍過程進(jìn)一步提高卵母細(xì)胞的冷卻/升溫速率，降低CPA 的毒性以及減少冷凍過程中產(chǎn)生的滲透脅迫和氧化應(yīng)激，將會(huì)極大的提高凍融后卵母細(xì)胞的存活率以及經(jīng)體外受精或ICSI 產(chǎn)生能夠移植的優(yōu)質(zhì)胚胎的能力。高效的卵母細(xì)胞冷凍保存方法將快速推進(jìn)豬克隆技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)豬基因庫的建立，并有助于人們使用豬模型來檢測(cè)相關(guān)技術(shù)對(duì)人類的安全性。