唐 毓，楊鎰峰，張 穎，王 巖，薛海龍，許保增

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112）

生殖技術(shù)在任何物種中的廣泛應(yīng)用都離不開配子和胚胎的超低溫保存，而卵母細胞的冷凍保存效率直接決定著人類輔助生殖以及動物生殖研究領(lǐng)域的發(fā)展進程。人們對于卵母細胞冷凍保存的研究至今已有四十多年的歷史，目前常用于卵母細胞冷凍保存的方法主要有傳統(tǒng)的慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。而玻璃化冷凍法是公認的冷凍保存卵母細胞最安全、最有效的方法，現(xiàn)已被成功應(yīng)用于人類、兔、牛、羊等卵母細胞的冷凍保存。豬卵母細胞的超低溫保存具有重要的農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學意義。豬是我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)，其卵母細胞的冷凍保存可有效降低優(yōu)良品種遺傳資源的維護成本，防止因感染、疾病、遺傳漂變造成的損失，加快良種繁育進程。此外，豬作為人類生殖醫(yī)學研究重要的動物模型，在生理和免疫學上與人類有許多相似之處，豬卵母細胞的高效保存可以為人類提供大量的活卵母細胞來測試相關(guān)技術(shù)的安全性。與牛、羊等大家畜相比，豬卵母細胞的特點是胞漿內(nèi)脂質(zhì)含量相對較高，這些脂滴在冷卻和升溫過程中經(jīng)常會引起細胞內(nèi)線粒體、膜質(zhì)結(jié)構(gòu)、皮質(zhì)顆粒、紡錘體和細胞骨架的基本成分（微管和微絲）嚴重損傷，這是限制豬卵母細胞冷凍保存的主要障礙。雖然已有從玻璃化冷凍保存的豬卵母細胞中獲得活產(chǎn)子代的報道，但玻璃化冷凍后的豬卵母細胞存活率低、發(fā)育潛能差的問題始終制約著其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。近幾年，人們對提高豬卵母細胞冷凍效率進行了大量研究，其中包括冷凍保護劑（Cryoprotectant，CPA）和冷凍裝置的篩選與開發(fā)，以及降低卵母細胞脂滴含量、添加抗氧化劑、優(yōu)化細胞體積調(diào)控減少滲透脅迫損傷等方法，有效提高了玻璃化冷凍卵母細胞的存活率和移植后的產(chǎn)仔率。本文對豬卵母細胞冷凍保存的常用方法，玻璃化冷凍對卵母細胞造成的損傷類型以及針對不同的冷凍損傷所提出的解決方案進行綜述，為提高豬卵母細胞的冷凍保存效率提供參考依據(jù)。

1 卵母細胞的冷凍保存方法

1.1 慢速冷凍法 1972 年Whittingham 等首次采用慢速冷凍法保存小鼠胚胎并在解凍后獲得活產(chǎn)子代，隨后，又在1977 年利用慢速冷凍成功冷凍保存小鼠卵母細胞并獲得后代，自此人們便開啟了哺乳動物卵母細胞冷凍保存的探索之旅。慢速冷凍是通過將卵母細胞暴露于濃度≤1.5 mol/L 的滲透性冷凍保護劑和濃度≤0.3 mol/L 的非滲透性冷凍保護劑中緩慢脫水。在此期間，利用可編程的冷凍設(shè)備將卵母細胞緩慢降溫（0.3℃/min）至-30℃，之后迅速降溫（50℃/min）至-150℃保存于液氮中。在慢速冷凍過程中，卵母細胞在15～-4℃范圍內(nèi)最易形成體積較大的冰晶，而形成的冰晶會對卵母細胞造成許多不可逆的損傷，嚴重影響解凍后卵母細胞的存活率以及后期發(fā)育能力。豬卵母細胞由于脂肪含量高，對低溫極其敏感，慢速冷凍過程中形成的冰晶會引起卵母細胞大量死亡，冷凍保存異常困難，至今還未見采用傳統(tǒng)慢速冷凍技術(shù)冷凍豬卵母細胞獲得活產(chǎn)仔豬的報道。此外，慢速冷凍需要可編程的冷凍設(shè)備，冷凍時間長，冷凍損傷大，這些缺點限制了其在實際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

1.2 玻璃化冷凍法 隨著人們對卵母細胞和胚胎冷凍保存研究的不斷深入，慢速冷凍已經(jīng)無法滿足人們的需求，尋求新的冷凍方法成為人們追求的目標。1985 年Rall等首次采用玻璃化冷凍法成功保存小鼠胚胎，該方法可有效減少冰晶生成所引起的機械性損傷，具有快速、簡便、高效等優(yōu)點。玻璃化冷凍通常是先將卵母細胞暴露于低濃度的冷凍保護劑（Cryoprotectant，CPA）中進行平衡，在置于冷凍裝置之前快速暴露于高濃度的冷凍保護劑（≤1 min）中促使卵母細胞中的液體迅速轉(zhuǎn)變成玻璃狀無定形固體，然后將開放或封閉式的冷凍裝置立即投入液氮中使細胞迅速降溫（>10 000℃/min）進入凝固狀態(tài)，從而減少冷凍過程中冰晶的形成。目前，玻璃化冷凍技術(shù)已成功應(yīng)用在豬卵母細胞和胚胎保存中，并通過凍融后的豬胚胎和卵母細胞獲得活產(chǎn)子代。但玻璃化冷凍過程中高濃度的冷凍保護劑會對細胞產(chǎn)生毒性和滲透脅迫，冷凍后的豬卵母細胞存活率以及受精后的發(fā)育能力仍然低于其他物種，這些問題導(dǎo)致豬卵母細胞冷凍難以得到廣泛的商業(yè)化應(yīng)用。因此，深入了解冷凍損傷的類型和機制，為改善冷凍對卵母細胞造成的致命或不可逆?zhèn)μ峁├碚撘罁?jù)，有利于開發(fā)豬卵母細胞的冷凍保存方法。

2 豬卵母細胞玻璃化冷凍的損傷

冷凍過程中的任何一個環(huán)節(jié)都可能對卵母細胞造成損傷，如滲透性保護劑毒性，冷凍/解凍過程中帶來的滲透壓損傷及冰晶損傷等，以及玻璃化所引起的一系列細胞生物學性狀的改變，例如透明帶過早硬化、減數(shù)分裂紡錘體異常、氧化應(yīng)激以及早期凋亡等，嚴重制約豬卵母細胞的玻璃化冷凍效率，影響其后期發(fā)育潛能。

2.1 冷凍損傷

2.1.1 滲透性保護劑毒性 卵母細胞在玻璃化冷凍過程中通過具有高滲透性的CPA 穿過細胞膜產(chǎn)生滲透梯度，促進細胞內(nèi)的水外排（脫水），將細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化為無定形狀態(tài)，當溫度快速降低時減少冰晶的形成，降低細胞膜和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷，同時利用非滲透性CPA 在冷凍過程中吸收細胞內(nèi)的游離水。目前，常用于豬卵母細胞玻璃化冷凍的保護劑包括乙二醇（Ethylene Glycol，EG）、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、丙二醇（Propylene Glycol，PG）等滲透性CPA 和蔗糖（Sucrose）、海藻糖（Trehalose）、聚蔗糖（Ficoll）等非滲透性CPA。長時間暴露于高濃度的滲透性CPA容易引起細胞毒性效應(yīng)和滲透性休克。在玻璃化冷凍降溫過程中卵母細胞在高濃度的DMSO 中室溫作用1 min，解凍培養(yǎng)后會得到較高的細胞成熟率，而37℃作用5 min 則會誘發(fā)卵母細胞孤雌激活。經(jīng)過多年的研究，EG 是公認的卵母細胞玻璃化冷凍最有效的低毒性CPA，凍融后存活率高，但作用時間過長或者溫度過高都會引起卵母細胞受損，影響玻璃化冷凍效果。豬卵母細胞是大體積的球型結(jié)構(gòu)，其表面積與體積之比低，因此需要暴露在CPA 中更多的時間進行平衡，從而增加了CPA 毒性對細胞的損傷。

2.1.2 細胞骨架損傷 在平衡過程中，卵母細胞暴露在高濃度的CPA 中產(chǎn)生滲透壓梯度，引起細胞內(nèi)外的水交換導(dǎo)致細胞體積劇烈波動，從而導(dǎo)致細胞破裂。此外，卵母細胞在冷凍過程中，突然降低溫度會導(dǎo)致細胞內(nèi)對溫度敏感型的結(jié)構(gòu)造成損傷。GV 期卵母細胞的透明帶和卵丘細胞構(gòu)成功能單元，卵丘細胞絨毛通過透明帶延伸，形成縫隙連接，與卵母細胞溝通并向卵母細胞提供成熟所需的營養(yǎng)。在體外受精過程中，卵丘細胞在促進精子獲能和防止多精受精發(fā)揮重要作用。卵母細胞在玻璃化冷凍平衡過程中，細胞脫水而導(dǎo)致透明帶破裂，引起卵丘細胞與卵母細胞之間的縫隙連接被中斷，進而影響卵母細胞發(fā)育成熟所需的能量供給。此外，微管相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)微管的組裝并參與其他細胞成分的相互作用，聚合的微管蛋白與胞質(zhì)中游離的微管蛋白處于平衡狀態(tài)，玻璃化可能觸發(fā)微管蛋白解聚，進一步誘導(dǎo)微管的解聚和紡錘體的混亂甚至消失。

2.2 非冷凍損傷

2.2.1 透明帶過早硬化 在卵母細胞成熟（Meiosis Phase II，MII 期）后，皮質(zhì)顆粒細胞位于卵質(zhì)膜內(nèi)，在受精時發(fā)生配子融合后，皮質(zhì)顆粒釋放進入卵黃周隙，引起透明帶硬化，為多精受精提供生理屏障。Gook 等發(fā)現(xiàn)冷凍后卵母細胞的顆粒細胞會提前釋放到卵周隙中，引起透明帶過早硬化，阻礙精子受精，而冷凍保存的卵母細胞有近三分之二的顆粒細胞會提早釋放，從而影響卵母細胞的受精發(fā)育能力。

2.2.2 減數(shù)分裂紡錘體異常 減數(shù)分裂不同階段的豬卵母細胞對低溫的敏感度存在差異。成熟卵母細胞微管組裝并形成紡錘體且膜通透性較高，對低溫極為敏感；未成熟的卵母細胞微管未形成紡錘體，因此對冷凍敏感性較低，進行玻璃化冷凍可獲得更高比例的囊胚。研究指出豬卵母細胞暴露在24℃室溫5 min 后紡錘體開始解聚，降溫至4℃時可加快誘導(dǎo)紡錘體主軸解聚，導(dǎo)致染色體錯位或移位。卵母細胞染色體通過捕獲微管的著絲點沿紡錘體的赤道板排列，以保證受精后染色體的準確分離，當染色體被破壞時，微管在染色體周圍聚集，無法形成正常的染色體，最終引起受精發(fā)育異常。雖然卵母細胞紡錘體在復(fù)溫后可以進行再組裝，但不同物種的卵母細胞紡錘體的再組裝程度存在較大差異。豬的卵母細胞在GV 期的染色質(zhì)仍處于去致密狀態(tài)，未形成微管組織中心，微管系統(tǒng)未形成，但其冷凍后存活率和發(fā)育潛能也會降低。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中，在低溫保護劑的作用下紡錘體的結(jié)構(gòu)可能會被保存下來，但在解凍過程中，紡錘體的結(jié)構(gòu)則會完全喪失，最終將可能導(dǎo)致染色體異常和非整倍體的發(fā)生。

2.2.3 氧化應(yīng)激與早期凋亡 活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）主要來源于線粒體和膜質(zhì)，生物體處于平衡狀態(tài)的ROS 可以調(diào)節(jié)Ca的平衡和糖代謝穩(wěn)定，并能夠活化和抑制細胞內(nèi)多種信號因子。高水平的ROS 會引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，影響能量代謝，最終導(dǎo)致卵母細胞發(fā)育潛能降低。玻璃化冷凍過程中，卵母細胞內(nèi)的活性氧水平顯著升高，從而造成線粒體損傷，破壞卵母細胞質(zhì)膜，引起卵母細胞的DNA 損傷，誘導(dǎo)細胞凋亡。同時，高濃度的ROS會抑制DNA 修復(fù)酶和抗氧化蛋白酶，使細胞內(nèi)的DNA產(chǎn)生高突變性，從而損傷卵細胞的發(fā)育潛能。

2.2.4 表觀遺傳修飾改變 表觀遺傳是指在細胞分裂過程中，在不改變核苷酸序列的情況下，以可遺傳的方式使遺傳物質(zhì)表達多樣化的過程。表觀遺傳機制在哺乳動物卵子發(fā)生中起著重要作用，當卵母細胞進入第一次減數(shù)分裂時，轉(zhuǎn)錄停止，直至受精發(fā)育成胚胎后恢復(fù)轉(zhuǎn)錄。然而，在這個階段，卵母細胞基因表達的變化主要依賴于轉(zhuǎn)錄的翻譯和降解。而合成的蛋白依賴于翻譯后修飾的調(diào)控，如磷酸化、去磷酸化、泛素化、SUMO 化和已有轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以精確調(diào)控卵母細胞的成熟過程。此外，研究發(fā)現(xiàn)胚胎中發(fā)生的所有表觀遺傳修飾在很大程度上取決于卵母細胞中儲存的母源mRNA表達的表觀遺傳修飾酶的水平。因此，卵母細胞時期需要合成和保存減數(shù)分裂完成、受精和卵母細胞-胚胎轉(zhuǎn)變期間所需的所有轉(zhuǎn)錄本（特別是表觀遺傳修飾酶的表達）。而卵母細胞在玻璃化冷凍過程中發(fā)生任何對基因組完整性或轉(zhuǎn)錄本合成、抑制和穩(wěn)定性相關(guān)、以及與翻譯機制相關(guān)的損傷都可能對蛋白質(zhì)表達和關(guān)鍵的生物學事件產(chǎn)生重大影響。玻璃化冷凍對表觀遺傳修飾的影響發(fā)生在卵母細胞發(fā)育過程中，直接或間接地影響著染色體的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍會引起豬卵母細胞組蛋白H4ac 水平升高，H3K9me 水平下降，導(dǎo)致卵母細胞染色質(zhì)在受精過程中的表觀遺傳修飾異常，降低玻璃化冷凍豬卵母細胞發(fā)育能力。此外，玻璃化冷凍還會引起豬卵母細胞線粒體功能相關(guān)基因表達（）下調(diào)，導(dǎo)致凍融后的豬卵母細胞線粒體分布和功能異常，降低細胞受精發(fā)育能力。

3 改善豬卵母細胞冷凍保存的方法

豬卵母細胞的玻璃化冷凍技術(shù)相對于其他哺乳動物仍處于相對滯后的階段。近年來，人們不斷致力于優(yōu)化豬卵母細胞玻璃化冷凍方法，開發(fā)新技術(shù)、新途徑用以改善豬卵母細胞冷凍效率低的困境。目前針對于卵母細胞玻璃化冷凍的研究主要集中于篩選新類型的CPA以及濃度，開發(fā)新型的冷凍載體，優(yōu)化細胞體積，以及在冷凍保護劑中添加抗氧化劑等方面。

3.1 冷凍保護劑的選擇 CPA 根據(jù)其滲透性分為滲透型和非滲透性兩種，滲透性CPA 與水分子形成氫鍵，可以防止冰晶形成，保護細胞不受溶液效應(yīng)的影響。非滲透劑不僅可以在冷凍過程中吸收細胞內(nèi)的游離水，還可以在解凍升溫過程中吸收細胞內(nèi)的CPA。然而，高濃度的單個CPA 對細胞是具有毒性作用，而低濃度的單個CPA 毒性較小，因此，玻璃化方法通常使用2 個或多個CPA 的組合，如15%（v/v）EG 和15%（v/v）DMSO或PROH，合并添加0.5 mol/L 蔗糖用于玻璃化冷凍，有助于進一步降低CPA 對卵母細胞的毒性。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞在解凍過程中去除細胞內(nèi)CPA 產(chǎn)生的滲透梯度會引起細胞大量吸收水分，導(dǎo)致細胞體積迅速膨脹，造成卵母細胞致死性損傷。為此，人們通過使用蛋白質(zhì)（人血清白蛋白或血清替代品）或糖（葡萄糖或蔗糖）等的保護劑，控制CPA 的去除速率，避免細胞體積驟然變大。開發(fā)新型冷凍保護劑是提高卵母細胞冷凍保存效率的有效方法，Mamoshita 等將羧化多聚賴氨酸引入CPA 有效減少了哺乳動物卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍所造成的物理和生理性損傷，冷凍后的豬胚胎囊胚率可提高至19.4%±4.6%，顯著高于未添加組1.3%±1.0%，為進一步提高哺乳動物卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍效果提供一種新的CPA。

3.2 保護細胞骨架 玻璃化冷凍對于細胞骨架的損傷直接影響解凍后卵母細胞的存活率和后續(xù)發(fā)育能力。近年來，研究證實多種細胞骨架穩(wěn)定劑對于哺乳動物卵母細胞的低溫保存具有保護作用，目前使用最廣泛的包括細胞松弛素B（Cytochalasin B，CB）和紫杉醇（Paclitaxel，PT）。細胞松弛素B 是激動蛋白聚合的抑制劑，可與F-肌動蛋白的正（+）端結(jié)合，阻斷F-肌動蛋白的功能，使細胞更富有彈性，研究證實其在一定程度上減少玻璃化過程引起的細胞骨架系統(tǒng)的破壞。玻璃化前使用細胞松弛素B 處理可降低豬GV 期卵母細胞微管損傷，維持MII 期正常紡錘體結(jié)構(gòu)，單精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）后更利于囊胚發(fā)育。

紫杉醇具有促進微管蛋白聚合，抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定的作用。因此，在玻璃化過程中添加紫杉醇可有效降低微管的損傷，減少紡錘體異常現(xiàn)象的發(fā)生。玻璃化前對豬卵母細胞進行紫杉醇處理，可顯著改善卵母細胞的孤雌發(fā)育，卵裂率由5.6%提高至24.3%。此外，研究表明，紫杉醇具有促進微管蛋白在體外重新組裝的作用，而卵母細胞的微管細胞骨架網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)細胞內(nèi)不同區(qū)域線粒體的轉(zhuǎn)移機制。采用紫杉醇預(yù)處理的卵母細胞，經(jīng)玻璃化冷凍后可顯著改善卵母細胞中線粒體的分布情況。

3.3 優(yōu)化冷凍載體 豬卵母細胞的脂質(zhì)含量高于其他物種，至今還沒有采用傳統(tǒng)慢速冷凍技術(shù)冷凍豬卵母細胞產(chǎn)活豬的報道。1998 年Isachenko 等首次將玻璃化冷凍技術(shù)用于豬GV 期卵母細胞低溫保存，采用0.25 mL麥管作為冷凍載體，冷凍后的卵母細胞成功在體外發(fā)育至囊胚期。影響玻璃化的一個重要因素是樣品的體積，樣品越小，需要冷凍的液體就越少，形成冰晶的概率就越低，為提高玻璃化冷凍效率，應(yīng)盡可能地減少冷凍過程中玻璃化液體的體積。目前人們常用的冷凍載體包括開放式拉長麥管（OPS）、冷凍環(huán)（Cryoloop）、金屬塊（SSV）、冷凍葉（Cryoleaf）以及微滴法（Microdroplet）等。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍過程中對卵母細胞的潛在毒性隨降溫速率增加而減少，因此改良冷凍載體材質(zhì)與構(gòu)造，對于提高卵母細胞玻璃化冷凍的降溫和升溫速率，降低CPA 的毒性作用具有重要意義。

3.4 降低脂質(zhì)含量 在豬卵母細胞和早期胚胎中具有大而豐富的脂滴，隨著胚胎進入囊胚期，脂滴的大小和豐度逐漸降低。因此在卵母細胞冷凍保存過程中，降低溫度會引起細胞質(zhì)脂滴由液相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z相，進而導(dǎo)致膜完整性降低，造成細胞死亡。因此，降低豬卵母細胞中脂滴的含量是決定其冷凍成功與否的關(guān)鍵，Park 等首次采用離心法使細胞質(zhì)脂滴極化，再通過顯微操作去除部分脂質(zhì)，有效提高了玻璃化豬卵母細胞的體外成熟率。但顯微操作去脂過程中極易造成細胞透明帶損傷，同時也增加了病原體傳播的可能性；隨后，Spate 等在玻璃化冷凍前采用高滲透離心技術(shù)處理豬胚胎，凍融后獲得了高存活率的豬胚胎。此外，人們嘗試在解凍后進行體外成熟的豬卵母細胞中添加Forskolin（脂解刺激劑），培養(yǎng)42 h 的卵母細胞存活率比對照組提高20%，但未顯著提高冷凍后豬卵母細胞的卵裂率。

3.5 添加有機滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì) 在玻璃化過程中，通過少量高濃度的CPA 實現(xiàn)卵母細胞的超快速冷凍，研究表明高滲環(huán)境和異常的滲透壓引起細胞體積的急劇改變。哺乳動物卵母細胞的體積調(diào)節(jié)依賴于細胞內(nèi)無機和有機滲透壓力調(diào)節(jié)小分子的濃度和種類。當細胞正常體積減少時，細胞首先激活無機滲透壓調(diào)節(jié)分子通道（如Na/H離子交換泵），通過提高細胞內(nèi)無機鹽離子的濃度而恢復(fù)細胞體積。然而，高濃度的無機鹽離子會影響正常細胞內(nèi)正負電荷平衡，此時，細胞通過激活不帶電荷的有機滲透調(diào)節(jié)小分子通道（如甘氨酸轉(zhuǎn)運子GLYT1）置換無機滲透分子，從而達到滲透壓平衡。而當細胞體積增大時，細胞激活體積調(diào)控的陰離子通道（Cl），排出無機陰離子和有機小分子，降低離子濃度從而恢復(fù)細胞形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍保護劑中添加一些有機滲透壓調(diào)節(jié)小分子（如甘氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺等）可有效減少卵母細胞冷凍/解凍時的滲透壓力，使細胞體積快速達到穩(wěn)態(tài)。Cao 等在冷凍過程中添加有機滲透壓調(diào)節(jié)小分子甘氨酸，通過增強細胞Na/K泵功能，參與改變細胞內(nèi)離子分布調(diào)節(jié)滲透壓，有效的減少了冷凍/解凍過程中卵母細胞的滲透脅迫，提高小鼠卵母細胞冷凍后的成活率及后續(xù)發(fā)育能力。

3.6 添加抗氧化劑 卵母細胞在冷凍過程中氧化應(yīng)激與細胞凋亡是造成其凍融后存活力下降的主要因素之一。近年來，人們發(fā)現(xiàn)褪黑激素具有清除細胞自由基，抑制脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)保護細胞結(jié)構(gòu)、防止DNA 損傷、降低體內(nèi)過氧化物含量的作用。卵母細胞的玻璃化冷凍過程中添加褪黑素可有效提高卵母細胞的冷凍效率。Zhang 等將褪黑素應(yīng)用于人類卵母細胞冷凍保存中，發(fā)現(xiàn)通過抑制氧化應(yīng)激和維持卵膜通透性來改善人卵母細胞的低溫保存效果。而在玻璃化冷凍保護液中添加10mol/L 褪黑素可顯著降低玻璃化冷凍后牛卵母細胞的ROS 水平，抑制其細胞凋亡，從而增加解凍后卵母細胞的發(fā)育潛力，但是在豬卵母細胞的玻璃化冷凍過程中還未見使用褪黑素的報道。此外，人們發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl Cysteine，NAC）是含有硫醇基團和半胱氨酸前體的抗氧化劑，被細胞攝取后用于谷胱甘肽的合成，在玻璃化保護劑中添加對羊卵母細胞的發(fā)育能力具有顯著提升。這些抗氧化劑的研究與開發(fā)為提高豬卵母細胞的冷凍效率提供更多的可能性。

4 展 望

豬卵母細胞獨特的生物學性狀制約著其玻璃化冷凍保存的發(fā)展進程，現(xiàn)有的冷凍保存方案對豬卵母細胞的活力和發(fā)育能力仍存在較大損傷，無法滿足人們的需求。隨著對豬卵母細胞冷凍損傷研究的不斷深入，在玻璃化冷凍過程進一步提高卵母細胞的冷卻/升溫速率，降低CPA 的毒性以及減少冷凍過程中產(chǎn)生的滲透脅迫和氧化應(yīng)激，將會極大的提高凍融后卵母細胞的存活率以及經(jīng)體外受精或ICSI 產(chǎn)生能夠移植的優(yōu)質(zhì)胚胎的能力。高效的卵母細胞冷凍保存方法將快速推進豬克隆技術(shù)的發(fā)展，促進豬基因庫的建立，并有助于人們使用豬模型來檢測相關(guān)技術(shù)對人類的安全性。