范玲，唐佳蒙，王鑫，吳怡雯，金慶江，王深軍，陳國(guó)新△

（1.江蘇省蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215101；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 南京 225300）

白殘花-烏梅是臨床常用于治療口舌生瘡、口腔潰瘍的經(jīng)典藥對(duì)［1］。白殘花是薔薇科植物野薔薇RosamultifloraThunb.的干燥花，具有保肝［2］、抗炎、抑菌［3］、抗病毒、抗腫瘤［4］等功效，主要活性成分為三萜類（如熊果酸、齊墩果酸［5］）、黃酮類（如金絲桃苷、槲皮素［6］）、多糖等。烏梅是薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc 的干燥近成熟果實(shí)，主要活性成分為有機(jī)酸（如枸櫞酸［7］）、三萜類、甾醇［8］等，具有抑菌［9］、鎮(zhèn)咳［10］、鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥［11］等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏梅對(duì)桿菌、球菌等均有較強(qiáng)抑制作用，與白殘花相須為用，效果更甚。本研究中以綜合金絲桃苷含量及提取液的浸膏得率所得綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法優(yōu)選了白殘花-烏梅藥對(duì)的提取工藝，并將2種方法進(jìn)行比較?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；FA2004B 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；DW -2 型調(diào)溫電熱套（通州區(qū)張芝山鎮(zhèn)決也化工電器廠）；KQ5200 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；液相用溶劑過(guò)濾器；GM-0.33A 型隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

金絲桃苷對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為19050906，純度不低于98%）；乙腈（色譜純，上海展云化工有限公司）；其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；白殘花（批號(hào)為210311010），烏梅（批號(hào)為210225010），均購(gòu)于蘇州天靈中藥飲片有限公司，經(jīng)江蘇省蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院于棟偉主任中藥師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 金絲桃苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent EC -C18柱（150 mm × 4.6 mm，4μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：30 ℃；洗脫時(shí)間：25 min；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間有色譜峰出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 溶液制備

取金絲桃苷對(duì)照品14.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加100%甲醇溶解并定容，搖勻，制成對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加100%甲醇溶解并定容，搖勻，即得每1 mL含金絲桃苷56μg 的對(duì)照品溶液。按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，置合適的圓底燒瓶?jī)?nèi)，按正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各序列號(hào)下的條件，加水適量，回流煎煮，提取，4 層紗布過(guò)濾，合并得水煎液，冷卻后記錄體積；精密量取水煎液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加100%甲醇溶解，用10 mL容量瓶定容，0.45μm 微孔有機(jī)過(guò)濾器濾過(guò)，即得供試品溶液。稱取烏梅藥材10 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為56.00，14.00，11.20，5.60，1.12 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=38.42X-11.01，R2=1.000 0（n=5）。結(jié)果表明，金絲桃苷質(zhì)量濃度在1.12～56.00μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限和定量限確定：取2.1.2項(xiàng)對(duì)照品溶液適量，加100%甲醇逐級(jí)稀釋，按2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以信噪比（S/N）為3∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，以S/N為10∶1時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果檢測(cè)限和定量限分別為0.113 2μg/mL和0.372 3μg/mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取線性關(guān)系考察項(xiàng)下對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為11.20μg/mL），按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，于同日內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定6 次；每日連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定2次，連續(xù)測(cè)定3 d。結(jié)果峰面積的RSD分別為0.34%和0.96%（n=6），表明儀器日內(nèi)精密度和日間精密度均良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取正交試驗(yàn)序列表中的5 號(hào)水煎液，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD為0.56%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取正交試驗(yàn)序列表中的5 號(hào)水煎液，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD為0.78%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取正交試驗(yàn)序列表中的5號(hào)水煎液10 mL，共6份，分別置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，加100%甲醇溶解，用10 mL容量瓶定容，精確加入金絲桃苷對(duì)照品0.13 mg，超聲使溶解，搖勻，0.45μm微孔有機(jī)過(guò)濾器濾過(guò)，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果平均加樣回收率為96.53%，RSD為1.79%（n=6）。

2.2 浸膏得率

分別取正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)各組水煎液5 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，放入干燥器中冷卻0.5 h，得白殘花-烏梅藥對(duì)提取物的干浸膏，計(jì)算浸膏得率。

式中，l為水浴濃縮的提取液體積；L為煎煮后提取液的總體積；m為煎煮飲片的總質(zhì)量；m1為蒸發(fā)皿質(zhì)量；m2為含提取液的蒸發(fā)皿質(zhì)量。

2.3 單因素試驗(yàn)

以提取液中金絲桃苷含量為主要指標(biāo)［12-13］，同時(shí)計(jì)算浸膏得率，進(jìn)行單因素考察，并計(jì)算綜合評(píng)分。

加水量：按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，共5份，分別置合適的圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入10，15，20，25，30倍量水，加熱回流1.0 h，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2 項(xiàng)下方法制備干浸膏，按公式2）計(jì)算綜合評(píng)分。結(jié)果加入10～25倍量水時(shí)，綜合評(píng)分呈遞增趨勢(shì)；加入30 倍量水時(shí)，綜合評(píng)分降低。故選擇加25倍量水，詳見(jiàn)圖2 A。

提取時(shí)間：按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，共4份，分別置合適的圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入25 倍量水，分別回流煎煮0.5，1.0，1.5，2.0 h，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2 項(xiàng)下方法制備干浸膏，按公式2）計(jì)算綜合評(píng)分。結(jié)果提取1.0 h時(shí)，綜合評(píng)分為100.00分。故選擇提取1.0 h，詳見(jiàn)圖2 B。

提取次數(shù)：按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，共3份，分別置合適的圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入25 倍量水，回流提取1.0 h，分別提取1 次、2 次、3次，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2 項(xiàng)下方法制備干浸膏，按公式2）計(jì)算綜合評(píng)分。結(jié)果綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的增加而增加。故選擇提取3次，詳見(jiàn)圖2 C。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

按單因素試驗(yàn)結(jié)果，以加水量（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）為考察因素，以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)［14-16］優(yōu)選提取工藝。因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and their levels of the orthogonal test

由表2 中極差R值可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序由大至小依次為提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量。采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分影響顯著，加水量和提取時(shí)間對(duì)其影響不顯著。比較3個(gè)影響因素的K1，K2，K3的大小，選定A1B2C3為最佳提取工藝，即加20倍量水，提取3次，每次1.0 h。通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到綜合評(píng)分為90.28分（RSD=1.68%）。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA of the orthogonal test

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.5.1 因素與水平

按單因素試驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合Box -Behnken 響應(yīng)面法的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，以加水量（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）為自變量，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值，采用Box -Behnken 響應(yīng)面法［17-19］優(yōu)選提取工藝。因素與水平見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.4 Factors and their levels of the BBD-RSM

2.5.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5.3 模型建立與顯著性分析

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件分析表5中17組試驗(yàn)數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。得到二元回歸方程Y=94.61+2.15A-0.024B+12.85C-0.43AB-4.56AC+0.25BC-3.76A2-0.024B2-7.02C2。其中，A，B，C系數(shù)的大小反映該因素對(duì)金絲桃苷綜合評(píng)分影響的大小和方向。方差分析結(jié)果見(jiàn)表6?？梢?jiàn)，該模型的F=11.34，顯著性水平為P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型的失擬項(xiàng)F=1.34，顯著性水平為P=0.379 3>0.05，此項(xiàng)不顯著。所有數(shù)據(jù)充分顯示了該模型的回歸效果顯著，有較好的擬合度及很高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，故此模型可用于表示響應(yīng)值與自變量間的多元回歸關(guān)系。由表6中F值和顯著水平P值可知，一次項(xiàng)中僅因素C（提取次數(shù)）有顯著性（P<0.05），提取時(shí)間和加水量的差異均無(wú)顯著性（P>0.05），且3種影響因素的相互作用無(wú)意義；由F值可知，因素C（提取次數(shù)）>因素A（加水量）>因素B（提取時(shí)間）為各個(gè)自變量對(duì)綜合評(píng)分的影響順序，3個(gè)交互項(xiàng)的偏回歸系數(shù)均不顯著（P>0.05），表明加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)影響因素的交互項(xiàng)對(duì)綜合評(píng)分影響均不顯著（P>0.05）。二次項(xiàng)中僅C2（提取次數(shù)和提取次數(shù)的交互作用）差異有顯著性（P<0.05），其余均無(wú)顯著性（P>0.05）。

表5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.5 Design and results of the BBD-RSM

表6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.6 Results of ANOVA of the BBD-RSM

2.5.4 響應(yīng)面交互作用分析

在3 個(gè)影響因素中，取任意2 個(gè)因素分別作為X軸和Y軸，以綜合評(píng)分作為Z軸，采用Design -Expert 8.0.6.1 軟件創(chuàng)建兩因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的三維響應(yīng)面圖（圖3）。在響應(yīng)面圖中，曲面越陡峭，則該因素對(duì)所測(cè)得含量的影響越大［20］。

可見(jiàn)，綜合評(píng)分隨提取次數(shù)、加水量的增加而升高，其響應(yīng)面圖形表現(xiàn)得相對(duì)陡峭，且等高線輪廓近似橢圓形，表明兩因素間的相互作用相對(duì)較強(qiáng)（圖3 B）；而加水量和提取時(shí)間（圖3 A）、提取時(shí)間和提取次數(shù)（圖3 C）的響應(yīng)面圖形表現(xiàn)的曲線較平滑，表明這些因素相互作用的影響不明顯。由圖3 A 可知，綜合評(píng)分隨提取時(shí)間和加水量的增大呈現(xiàn)緩慢升高-降低趨勢(shì)，但變化較小。由圖3 B可知，當(dāng)提取次數(shù)為1～2次時(shí)，綜合評(píng)分隨加水量的增大而呈現(xiàn)逐漸升高-降低趨勢(shì)；當(dāng)提取次數(shù)達(dá)2次以上時(shí)，綜合評(píng)分隨加水量的變化而呈現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì)；當(dāng)加水量為20～25倍時(shí)，綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的增加而明顯升高；當(dāng)加水量達(dá)25 倍以上時(shí)，綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的變化而呈現(xiàn)緩慢升高-降低趨勢(shì)。由圖3 C 可知，當(dāng)提取時(shí)間為0.5～1.0 h時(shí)，綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的增加而明顯升高；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)1.0 h以上時(shí)，綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的增大而呈現(xiàn)升高-降低趨勢(shì)；當(dāng)提取次數(shù)為1～3次時(shí)，綜合評(píng)分隨提取時(shí)間的增加而呈現(xiàn)非常緩慢的升高趨勢(shì)，變化較小?？梢?jiàn)，加水量和提取次數(shù)對(duì)金絲桃苷綜合評(píng)分的影響較強(qiáng)，提取時(shí)間對(duì)其影響較弱，但也有一定作用。

2.5.5 最佳條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design -Expert 8.0.6.1 軟件求解回歸方程，得到白殘花-烏梅藥對(duì)的最佳提取條件為加26.67 倍量水，提取2.65次，每次0.99 h，在此提取條件下所得理論綜合評(píng)分為99.47分。根據(jù)實(shí)際情況將上述提取工藝修正為加25 倍量水，提取3次，每次1.0 h。平行3 次試驗(yàn)所得的綜合評(píng)分為97.85 分（RSD=1.52%），表明建立的模型和實(shí)際情況基本吻合。

3 討論

3.1 考察指標(biāo)選擇

白殘花-烏梅藥對(duì)對(duì)口舌生瘡、口腔潰瘍的治療作用是數(shù)個(gè)物質(zhì)共同作用的結(jié)果。其中，金絲桃苷具有抗真菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等活性，是白殘花藥材的有效成分之一，故應(yīng)選擇浸膏得率、金絲桃苷含量等作為研究指標(biāo)。在衡量分配系數(shù)時(shí)，金絲桃苷含量占0.7，浸膏得率占0.3。使用多指標(biāo)的綜合評(píng)分法避免了單一指標(biāo)的片面性，可以全面地分析多種指標(biāo)，且側(cè)重主要的影響因素，使分析結(jié)果更加客觀。

3.2 正交試驗(yàn)法與響應(yīng)面法比較

正交試驗(yàn)中，提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響顯著（P<0.05），而加水量、提取時(shí)間對(duì)其影響不顯著（P>0.05）；但響應(yīng)面試驗(yàn)分析顯示，加水量和提取次數(shù)有較強(qiáng)的交互影響，對(duì)綜合評(píng)分的影響較大。比較這2種方法，響應(yīng)面法可更好地表示響應(yīng)值與多因素的關(guān)系，尤其是這些因素相互間也有影響。正交試驗(yàn)法優(yōu)選出的最佳提取工藝為加20 倍量水，提取3次，每次1.0 h，綜合評(píng)分為90.28分；Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選出的最佳提取工藝為加25 倍量水，提取3次，每次1.0 h，綜合評(píng)分為97.85 分。故Box -Behnken 響應(yīng)面法更適合提取白殘花-烏梅藥對(duì)。