司徒文輝，謝詩婷，劉穎，王永剛，彭維，姚宏亮，3*（.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東省熱帶亞熱帶植物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 5075；.廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，南寧 53003；3.廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 5060）

生發(fā)片收載于《中藥成方制劑》第十七冊(cè)，由何首烏、女貞子、黑豆、黑棗、墨旱蓮、麥冬、牡丹皮、桑椹、地黃、山藥、茯苓、澤瀉12 味中藥組成[1]。具有滋補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)血、生發(fā)烏發(fā)的功效，用于肝腎不足、氣血虧虛所致的頭發(fā)早白，脫落，斑禿，全禿，脂溢性脫發(fā)。

中藥成分復(fù)雜，生發(fā)片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)何首烏進(jìn)行了定性和定量檢測(cè)，不能確保生發(fā)片的安全性、有效性和均一性。目前對(duì)生發(fā)片質(zhì)量研究較少，黃蓓蓓[2]曾建立生發(fā)片中總黃酮含量測(cè)定方法；曲珍儀等[3]用薄層鑒別對(duì)生發(fā)片中何首烏、墨旱蓮、麥冬、地黃4 種藥材進(jìn)行鑒別，用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定二苯乙烯苷、特女貞苷含量[4]。指紋圖譜具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，是中藥質(zhì)量控制有效手段，能很好地評(píng)價(jià)和控制中藥材及復(fù)方的質(zhì)量[5-7]，目前未有生發(fā)片指紋圖譜的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究采用HPLC 法構(gòu)建了生發(fā)片指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定了二苯乙烯苷、大豆苷、特女貞苷的含量，為完善生發(fā)片的質(zhì)量控制方法提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

十萬分之一電子分析天平（MS105DU，瑞士Mettler toledo 公司）；萬分之一電子分析天平（ME 204，瑞士Mettler toledo 公司）；超純水器（arium mini，德國Sartorius 公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國Dionex 公司）；UFLC-Triple-TOF-MS/MS 超快速高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Triple TOF 5600 plus（美國AB SCIEX 公司）。

1.2 試藥

2，3，5 ，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：110844-201713，純度：93.6%）、特女貞苷（批號(hào)：111926-201605，純度：93.3%）、大豆苷（批號(hào)：111738-201603，純度：93.3%）、芍藥苷（批號(hào)：110736-201438，純度：96.4%）對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院）。何首烏（批號(hào)：120934-201410）、 女貞子（批號(hào)：121041-201404）、黑豆（批號(hào)：120975-201406）、墨旱蓮（批號(hào)：120958-201407）、牡丹皮（批號(hào)：121490-201102）、 地黃（批號(hào)：121180-201506）、 茯苓（批號(hào)：121117-201509）、澤瀉（批號(hào)：121081-201406）、山藥（批號(hào)：121137-201606）、麥冬（批號(hào)：121013-201310）、大棗（批號(hào)：121040-201408）（對(duì)照藥材，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20180801，分析純）；甲醇（Honeywell，批號(hào)：Q8AG1H，色譜級(jí)）；磷酸（阿拉丁，批號(hào)：G1614094，色譜級(jí)）；水為超純水；28 批生發(fā)片均由廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，編號(hào)為S1 ～S20 的生發(fā)片作為研究集建立對(duì)照指紋圖譜；另8 批（S21 ～S28）生發(fā)片作為檢驗(yàn)集與對(duì)照指紋圖譜比較，具體見表1。

表1 生發(fā)片供試品批號(hào)Tab 1 Lot numbers of Shengfa tablets

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大豆苷、特女貞苷、芍藥苷適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL 含2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷35 μg、大豆苷10 μg、特女貞苷85 μg、芍藥苷50 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 分別取何首烏、女貞子、黑豆、墨旱蓮、牡丹皮、地黃、茯苓、澤瀉、麥冬、大棗和黑豆對(duì)照藥材各0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取生發(fā)片20 片，去糖衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及工藝制備缺何首烏、女貞子、黑豆的陰性樣品，并按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～105 min，5% ～60%A）；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25℃；指紋圖譜檢測(cè)波長：227 nm；含量測(cè)定檢測(cè)波長：250 nm（大豆苷）、320 nm（二苯乙烯苷）、227 nm（特女貞苷）。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI 電噴霧離子源，離子噴霧電壓負(fù)模式－4500 V；噴霧氣55 psi；輔助加熱器55 psi；離子源溫度550 ℃；氣簾氣35 psi；碰撞氣壓力10 psi，掃描范圍m/z100 ～2000，采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 生發(fā)片指紋圖譜的構(gòu)建

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：1801003），連續(xù)進(jìn)樣6 次。以6 號(hào)峰為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD分別為0.030%～0.17%，0.86%～4.6%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：1801003）， 分別在0、2、8、24、26、48 h 進(jìn)樣測(cè)定。以6 號(hào)峰為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.030%～0.42%，0.38%～3.3%。結(jié)果表明供試品溶液放置48 h 穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：1801003），按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)。以6 號(hào)峰為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.020%～0.10%，0.60%～3.8%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的構(gòu)建及相似度分析 取20 批（S1 ～S20）生發(fā)片，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012 版進(jìn)行評(píng)價(jià)。20 批生發(fā)片的色譜圖中有10 個(gè)共有峰穩(wěn)定重現(xiàn)，編號(hào)為1 ～10。對(duì)20 批生發(fā)片HPLC 指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立疊加色譜圖（見圖1），通過中位數(shù)法獲得生發(fā)片HPLC 對(duì)照指紋圖譜（見圖2）。

圖1 20 批生發(fā)片HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 20 batches Shengfa tablets

圖2 生發(fā)片HPLC 對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of Shengfa tablets

以6 號(hào)峰（二苯乙烯苷）作為參照峰，計(jì)算10 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，分別為0.19、0.33、0.77、0.87、0.94、1.00、1.03、1.12、1.47、1.51，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.05%～1.2%。20 批生發(fā)片的相似度均大于0.95，結(jié)果見表2，表明不同批次生發(fā)片質(zhì)量穩(wěn)定。

表2 20 批生發(fā)片相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity of 20 batches of Shengfa tablets

2.3.5 共有峰的指證及藥味歸屬分析 精密吸取對(duì)照藥材溶液以及供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，通過保留時(shí)間、光譜圖數(shù)據(jù)對(duì)比，得到10 個(gè)共有峰的歸屬，見圖3。

圖3 生發(fā)片指紋圖譜共有峰歸屬性Fig 3 Attribution peak fingerprint of characteristic peak of Shengfa tablets

通過UFLC-Triple TOF-MS/MS 技術(shù)手段，按“2.2.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液及對(duì)照藥材溶液進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)照品對(duì)照確證了其中4 個(gè)共有峰。通過保留時(shí)間、質(zhì)譜分析及文獻(xiàn)查詢，指認(rèn)1 號(hào)峰為沒食子酸[8]，2 號(hào)峰為原兒茶酸[9-10]，5、10 號(hào)峰為單帖苷類化合物[11]，7 號(hào)峰為異黃酮類化合物[12]，9 號(hào)峰為裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物[13]，共有峰的藥味歸屬分析結(jié)果見表3。

表3 生發(fā)片共有峰指證及藥味歸屬Tab 3 Identification and origin assignment of characteristic peaks in HPLC fingerprint

2.3.6 生發(fā)片指紋圖譜的驗(yàn)證 對(duì)8 批生發(fā)片（S21 ～S28）進(jìn)行測(cè)定，所得生發(fā)片HPLC-DAD指紋圖譜如圖4 所示，其中R 為對(duì)照指紋圖譜。對(duì)8 批生發(fā)片指紋圖譜與生發(fā)片HPLC 對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。2 批超出有效期的生發(fā)片與對(duì)照指紋圖譜的相似度低于0.90；6 批有效期內(nèi)的生發(fā)片相似度均大于 0.95。

表4 8 批生發(fā)片驗(yàn)證相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 4 Similarity of HPLC fingerprint of 8 batches of Shengfa tablets

圖4 8 批生發(fā)片HPLC 指紋圖譜驗(yàn)證Fig 4 Validation of HPLC fingerprint of 8 batches of Shengfa tablets

2.4 指紋圖譜同時(shí)對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，理論塔板數(shù)按特女貞苷計(jì)算應(yīng)不低于30 000；結(jié)果二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷均與其他組分達(dá)到基線分離，分離度大于1.5。

2.4.2 專屬性考察 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照藥材溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，在供試品色譜圖中呈現(xiàn)出與對(duì)照品二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷及其對(duì)應(yīng)對(duì)照藥材色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性樣品無干擾，具有良好專屬性，結(jié)果見圖5 ～7。

圖5 二苯乙烯苷含量測(cè)定專屬性試驗(yàn)（320 nm）Fig 5 Specificity test for determination of stilbene glycoside（320 nm）

圖6 特女貞苷含量測(cè)定專屬性試驗(yàn)（227 nm）Fig 6 Specificity test for determination of specnuezhenide（227 nm）

圖7 大豆苷含量測(cè)定專屬性試驗(yàn)（250 nm）Fig 7 Specificity test of daidzin content determination（250 nm）

2.4.3 線性關(guān)系考察 分別取二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成含二苯乙烯苷對(duì)照品1.68、3.35、6.70、16.75、23.45、33.50 μg·mL－1，含特女貞苷對(duì)照品4.36、8.71、17.42、43.55、60.97、87.10 μg·mL－1， 含大豆苷對(duì)照品0.56、1.13、2.26、5.65、7.91、11.30 μg·mL－1系列溶液；按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值A(chǔ)與進(jìn)樣質(zhì)量濃度C（μg·mL－1）進(jìn)行回歸分析，3 種成分在各自的濃度范圍內(nèi)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度C（μg·mL－1）與峰面積A值呈良好線性關(guān)系，見表5。

表5 3 種成分的線性關(guān)系Tab 5 Linearity of the 3 components

2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果3 個(gè)對(duì)照品峰面積的RSD分別為0.94%、0.91%和0.94%，表明該方法精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，放置0、2、8、24、26、48 h 后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液中二苯乙烯苷峰面積的RSD分別為1.6%、0.76%，特女貞苷峰面積的RSD分別為1.4%、0.73%，大豆苷峰面積的RSD分別為1.6%、0.83%。表明生發(fā)片供試品溶液及混合對(duì)照品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)：1801003）生發(fā)片樣品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品中二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷的平均含量分別為0.3652、0.7442、0.1459 mg·g－1，RSD值分別為0.46%、0.88%、0.91%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的生發(fā)片適量，平行6 份，分別精密加入適量的二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷對(duì)照品，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品中二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷的平均回收率分別為92.85%、99.13%、98.21%，RSD分別為2.5%、2.2%、2.2%。表明該方法回收率好。

2.4.8 樣品測(cè)定 取28 批生發(fā)片樣品，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷的含量，結(jié)果見表6。

表6 生發(fā)片的含量測(cè)定結(jié)果(mg/片)Tab 6 Content determination of Shengfa tablets (mg/tablet)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

通過比較乙腈-0.2%甲酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.1%磷酸等流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰分離度較好，基線較平，故選擇甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)波長的選擇

采用DAD 檢測(cè)器測(cè)定，二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷最大吸收波長分別為318.87、227.23、250.91 nm；在2020年版《中國藥典》一部何首烏藥材【含量測(cè)定】中二苯乙烯苷選擇320 nm 為檢測(cè)波長。因3 個(gè)色譜峰的保留時(shí)間比較接近，不能用切換波長的方法對(duì)3 個(gè)圖譜進(jìn)行合并，且為保證含量測(cè)定的準(zhǔn)確度，故選用成分最大吸收波長作為含量測(cè)定檢測(cè)波長，即在320 nm 下檢測(cè)二苯乙烯苷含量，227 nm、250 nm 分別檢測(cè)特女貞苷與大豆苷含量。

3.3 含量測(cè)定指標(biāo)成分的確定

用混合對(duì)照品確證了3 號(hào)峰芍藥苷、4 號(hào)峰大豆苷、6 號(hào)峰二苯乙烯苷和8 號(hào)峰特女貞苷，結(jié)合4 個(gè)峰的分離度、不對(duì)稱性、專屬性、耐用性等因素；綜合考慮，暫不把芍藥苷成分列入含量測(cè)定的檢測(cè)指標(biāo)。

3.4 指紋圖譜驗(yàn)證

2 批超出有效期的生發(fā)片為不合格樣品，與對(duì)照指紋圖譜的相似度低于 0.90。在后續(xù)含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，過期生發(fā)片中二苯乙烯苷含量均低于有效期內(nèi)的生發(fā)片；推測(cè)生發(fā)片過期后會(huì)有部分化學(xué)成分降解，所以相似度低于0.90。

4 結(jié)論

本研究建立了生發(fā)片HPLC 指紋圖譜，確定了10 個(gè)共有峰，并利用對(duì)照品和HPLC-MS 技術(shù)對(duì)這10 個(gè)共有峰進(jìn)行了確證和指認(rèn)，確認(rèn)它們是何首烏、女貞子、黑豆、牡丹皮、墨旱蓮5 味藥材的活性成分。在此基礎(chǔ)上，對(duì)何首烏、女貞子、黑豆的指標(biāo)性成分二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷進(jìn)行含量測(cè)定，全面有效地評(píng)價(jià)生發(fā)片的質(zhì)量。經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，表明所建立的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重復(fù)性良好，可為生發(fā)片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。