司徒文輝,謝詩婷,劉穎,王永剛,彭維,姚宏亮,3*(.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心,廣東省熱帶亞熱帶植物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 5075;.廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司,南寧 53003;3.廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所,廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室,廣州 5060)
生發(fā)片收載于《中藥成方制劑》第十七冊(cè),由何首烏、女貞子、黑豆、黑棗、墨旱蓮、麥冬、牡丹皮、桑椹、地黃、山藥、茯苓、澤瀉12 味中藥組成[1]。具有滋補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)血、生發(fā)烏發(fā)的功效,用于肝腎不足、氣血虧虛所致的頭發(fā)早白,脫落,斑禿,全禿,脂溢性脫發(fā)。
中藥成分復(fù)雜,生發(fā)片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)何首烏進(jìn)行了定性和定量檢測(cè),不能確保生發(fā)片的安全性、有效性和均一性。目前對(duì)生發(fā)片質(zhì)量研究較少,黃蓓蓓[2]曾建立生發(fā)片中總黃酮含量測(cè)定方法;曲珍儀等[3]用薄層鑒別對(duì)生發(fā)片中何首烏、墨旱蓮、麥冬、地黃4 種藥材進(jìn)行鑒別,用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定二苯乙烯苷、特女貞苷含量[4]。指紋圖譜具有整體性和模糊性的特點(diǎn),是中藥質(zhì)量控制有效手段,能很好地評(píng)價(jià)和控制中藥材及復(fù)方的質(zhì)量[5-7],目前未有生發(fā)片指紋圖譜的文獻(xiàn)報(bào)道。
本研究采用HPLC 法構(gòu)建了生發(fā)片指紋圖譜,同時(shí)測(cè)定了二苯乙烯苷、大豆苷、特女貞苷的含量,為完善生發(fā)片的質(zhì)量控制方法提供參考。
十萬分之一電子分析天平(MS105DU,瑞士Mettler toledo 公司);萬分之一電子分析天平(ME 204,瑞士Mettler toledo 公司);超純水器(arium mini,德國Sartorius 公司);數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE,昆山市超聲儀器有限公司);Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國Dionex 公司);UFLC-Triple-TOF-MS/MS 超快速高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(日本島津公司);Triple TOF 5600 plus(美國AB SCIEX 公司)。
2,3,5 ,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(批號(hào):110844-201713,純度:93.6%)、特女貞苷(批號(hào):111926-201605,純度:93.3%)、大豆苷(批號(hào):111738-201603,純度:93.3%)、芍藥苷(批號(hào):110736-201438,純度:96.4%)對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院)。何首烏(批號(hào):120934-201410)、 女貞子(批號(hào):121041-201404)、黑豆(批號(hào):120975-201406)、墨旱蓮(批號(hào):120958-201407)、牡丹皮(批號(hào):121490-201102)、 地黃(批號(hào):121180-201506)、 茯苓(批號(hào):121117-201509)、澤瀉(批號(hào):121081-201406)、山藥(批號(hào):121137-201606)、麥冬(批號(hào):121013-201310)、大棗(批號(hào):121040-201408)(對(duì)照藥材,中國食品藥品檢定研究院)。甲醇(廣州化學(xué)試劑廠,批號(hào):20180801,分析純);甲醇(Honeywell,批號(hào):Q8AG1H,色譜級(jí));磷酸(阿拉丁,批號(hào):G1614094,色譜級(jí));水為超純水;28 批生發(fā)片均由廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供,編號(hào)為S1 ~S20 的生發(fā)片作為研究集建立對(duì)照指紋圖譜;另8 批(S21 ~S28)生發(fā)片作為檢驗(yàn)集與對(duì)照指紋圖譜比較,具體見表1。
表1 生發(fā)片供試品批號(hào)Tab 1 Lot numbers of Shengfa tablets
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大豆苷、特女貞苷、芍藥苷適量,精密稱定,加甲醇溶解,制成每1 mL 含2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷35 μg、大豆苷10 μg、特女貞苷85 μg、芍藥苷50 μg 的混合對(duì)照品溶液。
2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 分別取何首烏、女貞子、黑豆、墨旱蓮、牡丹皮、地黃、茯苓、澤瀉、麥冬、大棗和黑豆對(duì)照藥材各0.25 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇10 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.1.3 供試品溶液的制備 取生發(fā)片20 片,去糖衣,研細(xì),取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇10 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過0.45 μm 濾膜,取續(xù)濾液,即得。
2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及工藝制備缺何首烏、女貞子、黑豆的陰性樣品,并按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液,即得。
2.2.1 色譜條件 色譜柱:Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0 ~105 min,5% ~60%A);流速:1 mL·min-1;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:25℃;指紋圖譜檢測(cè)波長:227 nm;含量測(cè)定檢測(cè)波長:250 nm(大豆苷)、320 nm(二苯乙烯苷)、227 nm(特女貞苷)。
2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI 電噴霧離子源,離子噴霧電壓負(fù)模式-4500 V;噴霧氣55 psi;輔助加熱器55 psi;離子源溫度550 ℃;氣簾氣35 psi;碰撞氣壓力10 psi,掃描范圍m/z100 ~2000,采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。
2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào):1801003),連續(xù)進(jìn)樣6 次。以6 號(hào)峰為參照,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD分別為0.030%~0.17%,0.86%~4.6%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。
2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào):1801003), 分別在0、2、8、24、26、48 h 進(jìn)樣測(cè)定。以6 號(hào)峰為參照,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.030%~0.42%,0.38%~3.3%。結(jié)果表明供試品溶液放置48 h 穩(wěn)定。
2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào):1801003),按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備6 份供試品溶液,進(jìn)樣檢測(cè)。以6 號(hào)峰為參照,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.020%~0.10%,0.60%~3.8%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.4 指紋圖譜的構(gòu)建及相似度分析 取20 批(S1 ~S20)生發(fā)片,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012 版進(jìn)行評(píng)價(jià)。20 批生發(fā)片的色譜圖中有10 個(gè)共有峰穩(wěn)定重現(xiàn),編號(hào)為1 ~10。對(duì)20 批生發(fā)片HPLC 指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,建立疊加色譜圖(見圖1),通過中位數(shù)法獲得生發(fā)片HPLC 對(duì)照指紋圖譜(見圖2)。
圖1 20 批生發(fā)片HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 20 batches Shengfa tablets
圖2 生發(fā)片HPLC 對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of Shengfa tablets
以6 號(hào)峰(二苯乙烯苷)作為參照峰,計(jì)算10 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間,分別為0.19、0.33、0.77、0.87、0.94、1.00、1.03、1.12、1.47、1.51,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.05%~1.2%。20 批生發(fā)片的相似度均大于0.95,結(jié)果見表2,表明不同批次生發(fā)片質(zhì)量穩(wěn)定。
表2 20 批生發(fā)片相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity of 20 batches of Shengfa tablets
2.3.5 共有峰的指證及藥味歸屬分析 精密吸取對(duì)照藥材溶液以及供試品溶液,進(jìn)樣檢測(cè),記錄色譜圖,通過保留時(shí)間、光譜圖數(shù)據(jù)對(duì)比,得到10 個(gè)共有峰的歸屬,見圖3。
圖3 生發(fā)片指紋圖譜共有峰歸屬性Fig 3 Attribution peak fingerprint of characteristic peak of Shengfa tablets
通過UFLC-Triple TOF-MS/MS 技術(shù)手段,按“2.2.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液及對(duì)照藥材溶液進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)照品對(duì)照確證了其中4 個(gè)共有峰。通過保留時(shí)間、質(zhì)譜分析及文獻(xiàn)查詢,指認(rèn)1 號(hào)峰為沒食子酸[8],2 號(hào)峰為原兒茶酸[9-10],5、10 號(hào)峰為單帖苷類化合物[11],7 號(hào)峰為異黃酮類化合物[12],9 號(hào)峰為裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物[13],共有峰的藥味歸屬分析結(jié)果見表3。
表3 生發(fā)片共有峰指證及藥味歸屬Tab 3 Identification and origin assignment of characteristic peaks in HPLC fingerprint
2.3.6 生發(fā)片指紋圖譜的驗(yàn)證 對(duì)8 批生發(fā)片(S21 ~S28)進(jìn)行測(cè)定,所得生發(fā)片HPLC-DAD指紋圖譜如圖4 所示,其中R 為對(duì)照指紋圖譜。對(duì)8 批生發(fā)片指紋圖譜與生發(fā)片HPLC 對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),結(jié)果見表4。2 批超出有效期的生發(fā)片與對(duì)照指紋圖譜的相似度低于0.90;6 批有效期內(nèi)的生發(fā)片相似度均大于 0.95。
表4 8 批生發(fā)片驗(yàn)證相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 4 Similarity of HPLC fingerprint of 8 batches of Shengfa tablets
圖4 8 批生發(fā)片HPLC 指紋圖譜驗(yàn)證Fig 4 Validation of HPLC fingerprint of 8 batches of Shengfa tablets
2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定,理論塔板數(shù)按特女貞苷計(jì)算應(yīng)不低于30 000;結(jié)果二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷均與其他組分達(dá)到基線分離,分離度大于1.5。
2.4.2 專屬性考察 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照藥材溶液各10 μL,進(jìn)樣測(cè)定,在供試品色譜圖中呈現(xiàn)出與對(duì)照品二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷及其對(duì)應(yīng)對(duì)照藥材色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰,陰性樣品無干擾,具有良好專屬性,結(jié)果見圖5 ~7。
圖5 二苯乙烯苷含量測(cè)定專屬性試驗(yàn)(320 nm)Fig 5 Specificity test for determination of stilbene glycoside(320 nm)
圖6 特女貞苷含量測(cè)定專屬性試驗(yàn)(227 nm)Fig 6 Specificity test for determination of specnuezhenide(227 nm)
圖7 大豆苷含量測(cè)定專屬性試驗(yàn)(250 nm)Fig 7 Specificity test of daidzin content determination(250 nm)
2.4.3 線性關(guān)系考察 分別取二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷對(duì)照品適量,加甲醇配制成含二苯乙烯苷對(duì)照品1.68、3.35、6.70、16.75、23.45、33.50 μg·mL-1,含特女貞苷對(duì)照品4.36、8.71、17.42、43.55、60.97、87.10 μg·mL-1, 含大豆苷對(duì)照品0.56、1.13、2.26、5.65、7.91、11.30 μg·mL-1系列溶液;按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以峰面積積分值A(chǔ)與進(jìn)樣質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)進(jìn)行回歸分析,3 種成分在各自的濃度范圍內(nèi),進(jìn)樣質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)與峰面積A值呈良好線性關(guān)系,見表5。
表5 3 種成分的線性關(guān)系Tab 5 Linearity of the 3 components
2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6 次,結(jié)果3 個(gè)對(duì)照品峰面積的RSD分別為0.94%、0.91%和0.94%,表明該方法精密度良好。
2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液,放置0、2、8、24、26、48 h 后進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液中二苯乙烯苷峰面積的RSD分別為1.6%、0.76%,特女貞苷峰面積的RSD分別為1.4%、0.73%,大豆苷峰面積的RSD分別為1.6%、0.83%。表明生發(fā)片供試品溶液及混合對(duì)照品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào):1801003)生發(fā)片樣品適量,按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份,進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品中二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷的平均含量分別為0.3652、0.7442、0.1459 mg·g-1,RSD值分別為0.46%、0.88%、0.91%。表明該方法重復(fù)性良好。
2.4.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的生發(fā)片適量,平行6 份,分別精密加入適量的二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷對(duì)照品,進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果供試品中二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷的平均回收率分別為92.85%、99.13%、98.21%,RSD分別為2.5%、2.2%、2.2%。表明該方法回收率好。
2.4.8 樣品測(cè)定 取28 批生發(fā)片樣品,分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,用外標(biāo)法計(jì)算二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷的含量,結(jié)果見表6。
表6 生發(fā)片的含量測(cè)定結(jié)果(mg/片)Tab 6 Content determination of Shengfa tablets (mg/tablet)
通過比較乙腈-0.2%甲酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.1%磷酸等流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相時(shí),各色譜峰分離度較好,基線較平,故選擇甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。
采用DAD 檢測(cè)器測(cè)定,二苯乙烯苷、特女貞苷和大豆苷最大吸收波長分別為318.87、227.23、250.91 nm;在2020年版《中國藥典》一部何首烏藥材【含量測(cè)定】中二苯乙烯苷選擇320 nm 為檢測(cè)波長。因3 個(gè)色譜峰的保留時(shí)間比較接近,不能用切換波長的方法對(duì)3 個(gè)圖譜進(jìn)行合并,且為保證含量測(cè)定的準(zhǔn)確度,故選用成分最大吸收波長作為含量測(cè)定檢測(cè)波長,即在320 nm 下檢測(cè)二苯乙烯苷含量,227 nm、250 nm 分別檢測(cè)特女貞苷與大豆苷含量。
用混合對(duì)照品確證了3 號(hào)峰芍藥苷、4 號(hào)峰大豆苷、6 號(hào)峰二苯乙烯苷和8 號(hào)峰特女貞苷,結(jié)合4 個(gè)峰的分離度、不對(duì)稱性、專屬性、耐用性等因素;綜合考慮,暫不把芍藥苷成分列入含量測(cè)定的檢測(cè)指標(biāo)。
2 批超出有效期的生發(fā)片為不合格樣品,與對(duì)照指紋圖譜的相似度低于 0.90。在后續(xù)含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn),過期生發(fā)片中二苯乙烯苷含量均低于有效期內(nèi)的生發(fā)片;推測(cè)生發(fā)片過期后會(huì)有部分化學(xué)成分降解,所以相似度低于0.90。
本研究建立了生發(fā)片HPLC 指紋圖譜,確定了10 個(gè)共有峰,并利用對(duì)照品和HPLC-MS 技術(shù)對(duì)這10 個(gè)共有峰進(jìn)行了確證和指認(rèn),確認(rèn)它們是何首烏、女貞子、黑豆、牡丹皮、墨旱蓮5 味藥材的活性成分。在此基礎(chǔ)上,對(duì)何首烏、女貞子、黑豆的指標(biāo)性成分二苯乙烯苷、特女貞苷、大豆苷進(jìn)行含量測(cè)定,全面有效地評(píng)價(jià)生發(fā)片的質(zhì)量。經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證,表明所建立的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重復(fù)性良好,可為生發(fā)片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。