侯海波,鄭建雄,李 廿,朱保林
(湖北竹溪人福藥業(yè)有限責(zé)任公司,湖北 十堰 442300)
睪酮是由男性的睪丸或女性的卵巢分泌的一種天然雄激素,具有維持肌肉強(qiáng)度及質(zhì)量、維持骨質(zhì)密度及強(qiáng)度、提神及提升體能等作用[1-2]。睪酮能影響多種身體機(jī)能及代謝,包括血生成、體內(nèi)鈣平衡、骨礦化作用、脂代謝、糖代謝等,同時(shí)睪酮還是合成丙酸睪酮、十一酸睪酮等甾體藥物的重要醫(yī)藥中間體[3-4]。睪酮在生產(chǎn)合成過(guò)程中使用的二類有機(jī)溶劑有甲醇、吡啶,三類有機(jī)溶劑有乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯。本研究按照ICH關(guān)于殘留有機(jī)溶劑指導(dǎo)原則的要求[5-6],建立頂空氣相色譜法測(cè)定睪酮中有機(jī)溶劑殘留量,并對(duì)該分析方法進(jìn)行驗(yàn)證[7-8]。
Agilent 7890B氣相色譜儀(配備FID檢測(cè)器,7697A頂空進(jìn)樣器及OpenLAB CDS工作站,美國(guó)Agilent公司);ME204E型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)。
睪酮(湖北竹溪人福藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):180601,180602,180603);N,N-二甲基甲酰胺(DMF,色譜純,Merck公司);甲醇,乙醇(分析純,國(guó)藥集團(tuán));甲酸乙酯,乙酸乙酯,吡啶(分析純,上海凌峰)。
色譜柱:Agilent DB-624型(30 m×0.53 mm,3.0 μm)毛細(xì)管柱;升溫程序:35 ℃保持10 min,然后以6 ℃/min的速率升溫至120 ℃,再以20 ℃/min的速率升溫至200 ℃,保持2 min;檢測(cè)器溫度250 ℃;進(jìn)樣口溫度220 ℃;分流比10:1;載氣為氮?dú)?,載氣流速2.0 ml/min;頂空進(jìn)樣,頂空平衡溫度100 ℃,平衡時(shí)間45 min;定量管溫度110 ℃;傳輸線溫度120 ℃;進(jìn)樣體積1000 μl。
2.2.1 定位溶液制備 精密稱取甲醇3.0 g,乙醇5.0 g,甲酸乙酯5.0 g,乙酸乙酯5.0 g,吡啶0.2 g,分別置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中,以DMF稀釋至刻度,搖勻;分別取上述溶液5 ml,置于不同100 ml量瓶中,以DMF稀釋至刻度,混勻;再分別取上述溶液1.0 ml,置于不同10 ml頂空瓶中,再加DMF2.0 ml,密封,混勻。
2.2.2 對(duì)照品貯備溶液制備 精密稱取甲醇3.0 g,乙醇5.0 g,甲酸乙酯5.0 g,乙酸乙酯5.0 g,吡啶0.2 g,置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中,以DMF稀釋至刻度,混勻;再移取上述溶液5 ml,置100 ml量瓶中,以DMF稀釋至刻度,混勻。
2.2.3 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品貯備溶液1.0 ml于10 ml頂空瓶中,加DMF 2.0 ml,密封,混勻。
2.2.4 供試品溶液制備 精密稱取睪酮0.5 g,置于10 ml頂空瓶中,加入DMF 3 ml,密封。
2.2.5 樣品加標(biāo)溶液制備 精密稱取睪酮0.5 g,置于10 ml頂空瓶中,加入對(duì)照品貯備溶液1.0 ml及DMF 2.0 ml,密封。
取DMF 3.0 ml,置10 ml頂空瓶中,密封,作為空白溶液;取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液、樣品加標(biāo)溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,結(jié)果表明加入睪酮后沒(méi)有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn),睪酮在此體系中穩(wěn)定,不與溶劑反應(yīng),見圖1。各溶劑的分離度良好,可滿足實(shí)驗(yàn)要求。見表1。
圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖
表1 溶劑保留時(shí)間及分離度
取6份樣品加標(biāo)溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的含量RSD分別為1.25 %,1.51 %,1.78 %,1.92 %,1.52 %。結(jié)果表明,該色譜條件下重復(fù)性良好。
信噪比(S/N)約為3時(shí)的溶液濃度為各溶劑的檢測(cè)限,甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的檢測(cè)限分別為1.67,3.67,0.66,0.42,0.04 μg/ml。
信噪比(S/N)約為10時(shí)的溶液濃度為各溶劑的定量限,甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的定量限分別為5.0,11.2,2.1,1.25,0.13 μg/ml。
取定量限溶液和0.4,0.8,1.0,1.2 ml對(duì)照品溶液各3份,分別置于15個(gè)不同頂空瓶中,并加DMF溶液至3 ml,密封,搖勻,按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)做線性回歸,得回歸方程,見表2。結(jié)果表明,各溶劑在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
表2 溶劑線性方程及相關(guān)系數(shù)
取已知含量的同一批樣品,精密稱取9份,每份0.5 g,置于10 ml頂空瓶中。分為3組,分別加入對(duì)照品貯備溶液0.8 ml(80 %濃度水平)、1.0 ml(100 %濃度水平)、1.2 ml(120 %濃度水平),再分別加入DMF溶液2 ml,密封,混勻,計(jì)算80 %,100 %及120 %濃度水平下各組分的回收率,結(jié)果見表3。
表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果
取12份樣品加標(biāo)溶液,平均分為6組,分別在正常條件、載氣流速1.8 ml/min、載氣流速2.2 ml/min、起始柱溫30 ℃、起始柱溫40 ℃和更換不同型號(hào)色譜柱[ZB-624型(30 m×0.32 mm,1.8 μm)毛細(xì)管色譜柱]條件下進(jìn)樣,計(jì)算各溶劑峰面積的RSD。結(jié)果,更換色譜柱后各溶劑未能檢出,正常條件、載氣流速1.8 ml/min、載氣流速2.2 ml/min、起始柱溫30 ℃、起始柱溫40 ℃條件下甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶峰面積的RSD分別為2.00 %,2.22 %,2.52 %,2.82 %,2.73 %,結(jié)果表明在特定色譜柱條件下耐用性良好。
取3批樣品(批號(hào):180601,180602,180603)依法測(cè)定,結(jié)果見表4。溶劑限度為:甲醇:≤3000 ppm;乙醇:≤5000 ppm;甲酸乙酯:≤5000 ppm;乙酸乙酯:≤5000 ppm;吡啶:≤200 ppm。結(jié)果表明各溶劑殘留量均符合限度要求。
表4 3批樣品中殘留溶劑檢測(cè)結(jié)果
本文建立頂空氣相色譜測(cè)定睪酮中甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶殘留溶劑的方法并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,該分析方法能有效分離甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶,且操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高、適用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確,適用于睪酮的殘留溶劑檢測(cè)。該方法同樣適用于生產(chǎn)工藝中使用甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶的其他甾體原料藥的殘留溶劑的檢測(cè)。