侯海波，鄭建雄，李 廿，朱保林

（湖北竹溪人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 十堰 442300）

睪酮是由男性的睪丸或女性的卵巢分泌的一種天然雄激素，具有維持肌肉強(qiáng)度及質(zhì)量、維持骨質(zhì)密度及強(qiáng)度、提神及提升體能等作用[1-2]。睪酮能影響多種身體機(jī)能及代謝，包括血生成、體內(nèi)鈣平衡、骨礦化作用、脂代謝、糖代謝等，同時(shí)睪酮還是合成丙酸睪酮、十一酸睪酮等甾體藥物的重要醫(yī)藥中間體[3-4]。睪酮在生產(chǎn)合成過(guò)程中使用的二類有機(jī)溶劑有甲醇、吡啶，三類有機(jī)溶劑有乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯。本研究按照ICH關(guān)于殘留有機(jī)溶劑指導(dǎo)原則的要求[5-6]，建立頂空氣相色譜法測(cè)定睪酮中有機(jī)溶劑殘留量，并對(duì)該分析方法進(jìn)行驗(yàn)證[7-8]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 7890B氣相色譜儀（配備FID檢測(cè)器，7697A頂空進(jìn)樣器及OpenLAB CDS工作站，美國(guó)Agilent公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）。

1.2 試劑

睪酮（湖北竹溪人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：180601，180602，180603）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，色譜純，Merck公司）；甲醇，乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；甲酸乙酯，乙酸乙酯，吡啶（分析純，上海凌峰）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624型（30 m×0.53 mm，3.0 μm）毛細(xì)管柱；升溫程序：35 ℃保持10 min，然后以6 ℃/min的速率升溫至120 ℃，再以20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min；檢測(cè)器溫度250 ℃；進(jìn)樣口溫度220 ℃；分流比10:1；載氣為氮?dú)?，載氣流速2.0 ml/min；頂空進(jìn)樣，頂空平衡溫度100 ℃，平衡時(shí)間45 min；定量管溫度110 ℃；傳輸線溫度120 ℃；進(jìn)樣體積1000 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 定位溶液制備 精密稱取甲醇3.0 g，乙醇5.0 g，甲酸乙酯5.0 g，乙酸乙酯5.0 g，吡啶0.2 g，分別置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，搖勻；分別取上述溶液5 ml，置于不同100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，混勻；再分別取上述溶液1.0 ml，置于不同10 ml頂空瓶中，再加DMF2.0 ml，密封，混勻。

2.2.2 對(duì)照品貯備溶液制備 精密稱取甲醇3.0 g，乙醇5.0 g，甲酸乙酯5.0 g，乙酸乙酯5.0 g，吡啶0.2 g，置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，混勻；再移取上述溶液5 ml，置100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，混勻。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品貯備溶液1.0 ml于10 ml頂空瓶中，加DMF 2.0 ml，密封，混勻。

2.2.4 供試品溶液制備 精密稱取睪酮0.5 g，置于10 ml頂空瓶中，加入DMF 3 ml，密封。

2.2.5 樣品加標(biāo)溶液制備 精密稱取睪酮0.5 g，置于10 ml頂空瓶中，加入對(duì)照品貯備溶液1.0 ml及DMF 2.0 ml，密封。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

取DMF 3.0 ml，置10 ml頂空瓶中，密封，作為空白溶液；取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液、樣品加標(biāo)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果表明加入睪酮后沒(méi)有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)，睪酮在此體系中穩(wěn)定，不與溶劑反應(yīng)，見圖1。各溶劑的分離度良好，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。見表1。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖

表1 溶劑保留時(shí)間及分離度

2.4 重復(fù)性

取6份樣品加標(biāo)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的含量RSD分別為1.25 %，1.51 %，1.78 %，1.92 %，1.52 %。結(jié)果表明，該色譜條件下重復(fù)性良好。

2.5 檢測(cè)限

信噪比（S/N）約為3時(shí)的溶液濃度為各溶劑的檢測(cè)限，甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的檢測(cè)限分別為1.67，3.67，0.66，0.42，0.04 μg/ml。

2.6 定量限

信噪比（S/N）約為10時(shí)的溶液濃度為各溶劑的定量限，甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的定量限分別為5.0，11.2，2.1，1.25，0.13 μg/ml。

2.7 線性試驗(yàn)

取定量限溶液和0.4，0.8，1.0，1.2 ml對(duì)照品溶液各3份，分別置于15個(gè)不同頂空瓶中，并加DMF溶液至3 ml，密封，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做線性回歸，得回歸方程，見表2。結(jié)果表明，各溶劑在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 溶劑線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品，精密稱取9份，每份0.5 g，置于10 ml頂空瓶中。分為3組，分別加入對(duì)照品貯備溶液0.8 ml（80 %濃度水平）、1.0 ml（100 %濃度水平）、1.2 ml（120 %濃度水平），再分別加入DMF溶液2 ml，密封，混勻，計(jì)算80 %，100 %及120 %濃度水平下各組分的回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 耐用性實(shí)驗(yàn)

取12份樣品加標(biāo)溶液，平均分為6組，分別在正常條件、載氣流速1.8 ml/min、載氣流速2.2 ml/min、起始柱溫30 ℃、起始柱溫40 ℃和更換不同型號(hào)色譜柱[ZB-624型（30 m×0.32 mm，1.8 μm）毛細(xì)管色譜柱]條件下進(jìn)樣，計(jì)算各溶劑峰面積的RSD。結(jié)果，更換色譜柱后各溶劑未能檢出，正常條件、載氣流速1.8 ml/min、載氣流速2.2 ml/min、起始柱溫30 ℃、起始柱溫40 ℃條件下甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶峰面積的RSD分別為2.00 %，2.22 %，2.52 %，2.82 %，2.73 %，結(jié)果表明在特定色譜柱條件下耐用性良好。

2.10 樣品測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)：180601，180602，180603）依法測(cè)定，結(jié)果見表4。溶劑限度為：甲醇：≤3000 ppm；乙醇：≤5000 ppm；甲酸乙酯：≤5000 ppm；乙酸乙酯：≤5000 ppm；吡啶：≤200 ppm。結(jié)果表明各溶劑殘留量均符合限度要求。

表4 3批樣品中殘留溶劑檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立頂空氣相色譜測(cè)定睪酮中甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶殘留溶劑的方法并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，該分析方法能有效分離甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶，且操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高、適用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于睪酮的殘留溶劑檢測(cè)。該方法同樣適用于生產(chǎn)工藝中使用甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶的其他甾體原料藥的殘留溶劑的檢測(cè)。