王 麗，趙 銳，張秋芳

（淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255000）

我國中藥材資源豐富，有12 000余種，不同地區(qū)用藥差異明顯，導(dǎo)致藥材來源復(fù)雜、品種多變，嚴(yán)重影響了中藥臨床用藥的療效及穩(wěn)定性。為保證中藥在臨床用藥中安全有效，中藥材的鑒定已成為中藥研究中的重要內(nèi)容。原植物（原動物）鑒定、顯微鑒定、性狀鑒定、理化鑒定等方法是較為常用的中藥材鑒定方法。但這些鑒定技術(shù)較易受生長環(huán)境、儲存、加工工藝及鑒定人員的主觀性等方面的影響。DNA條形碼等現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方式準(zhǔn)確度低、主觀性較強(qiáng)等缺陷，大大提高了中藥材鑒定的效率及準(zhǔn)確性，在中藥材的質(zhì)量控制方面有非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 常見分子技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)狀

限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析被稱為第一代分子標(biāo)記技術(shù)，是通過分析酶切片段的長度差異來進(jìn)行基因型差異分析的一種分子生物學(xué)手段，其特點(diǎn)是共顯性，能鑒別出純合與雜合基因型，且穩(wěn)定性好、重復(fù)性強(qiáng)。該方法的缺點(diǎn)是在鑒定不同物種時(shí)需選擇與其相對應(yīng)的探針，技術(shù)難度較大。此項(xiàng)技術(shù)在川貝母[1]，天麻[2]，白茅根[3]等植物類中藥材的基原鑒定、資源種類分析方面已有相關(guān)研究。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析屬于指紋圖譜類技術(shù)，該技術(shù)無需對植物進(jìn)行任何分子生物學(xué)探究，直接通過隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到多條不同分子量的譜帶，比較樣本間的差異便可做出物種鑒別。該方法的不足之處為穩(wěn)定性不強(qiáng)，重復(fù)率不夠高。該方法在竹節(jié)參[4]、廣藿香[5]、黃精[6]等常見的中藥材鑒定中應(yīng)用較為廣泛。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplication fragment length polymorphism，AFLP）分析是一種結(jié)合RFLP和PCR的指紋圖譜技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是無需事先合成引物或設(shè)計(jì)探針，且由于該技術(shù)對引物退火溫度有極高的要求，因此具有高重復(fù)性、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，但該技術(shù)需要研究者有較高的理論知識和實(shí)驗(yàn)技能，且費(fèi)用相對較高。近期該技術(shù)應(yīng)用于益智[7]、黨參[8]及粗莖秦艽[9]等中藥材的鑒定和種內(nèi)遺傳多樣性的分析研究工作。微衛(wèi)星即簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）技術(shù)和在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的簡單序列重復(fù)區(qū)間（inter-simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記分析可鑒定不同物種、同一物種的不同位點(diǎn)及同一位點(diǎn)不同等位基因之間的差異，可揭示更多的多態(tài)性。研究報(bào)道該技術(shù)可應(yīng)用于溫莪術(shù)[10]、金銀花[11]、黃芪[12]等植物的藥用研究及資源評價(jià)方面。缺點(diǎn)是其操作過程相對復(fù)雜，引物通用性較差，針對不同引物、不同材料使用的擴(kuò)增條件差異較大，需對反應(yīng)體系及條件反復(fù)摸索。

DNA條形碼技術(shù)作為新興的分子檢測技術(shù)有著其他檢測技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢。該技術(shù)只需選用一個(gè)或幾個(gè)簡短的基因片段就可對整個(gè)屬、科甚至多個(gè)科的絕大多數(shù)物種進(jìn)行鑒定。其操作更易實(shí)現(xiàn)自動化，鑒定過程相對于其他分子方法更快速?？衫没ヂ?lián)網(wǎng)等信息平臺對鑒定結(jié)果進(jìn)行全球化統(tǒng)一管理及共享等。

2 DNA條形碼技術(shù)在動、植物中藥材鑒定中的應(yīng)用

2.1 DNA條形碼技術(shù)簡述及鑒定流程

DNA條形碼技術(shù)是利用生物體內(nèi)能代表該物

種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段來進(jìn)行物種身份確認(rèn)的生物技術(shù)。DNA條形碼概念在2003年由加拿大動物學(xué)家Paul Hebert首次提出，之后受到廣泛關(guān)注，利用該技術(shù)可進(jìn)行物種間的快速自動鑒定。此項(xiàng)技術(shù)的主要操作及分析流程為：（1）對中藥材進(jìn)行預(yù)處理；（2）DNA提取；（3）PCR擴(kuò)增；（4）PCR產(chǎn)物檢測與純化；（5）序列測定及質(zhì)量評估。

2.2 DNA條形碼在植物類中藥材鑒定中的應(yīng)用

2.2.1 ITS/ITS2序列與植物類中藥材鑒定 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列存在于核糖體RNA，為核糖體RNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，該序列種屬特異性明顯，保守性強(qiáng)，易擴(kuò)增且具有足夠的可變性以區(qū)分密切相關(guān)的物種。Kress等[13]選取了10個(gè)常見條形碼，通過對7個(gè)科相關(guān)物種及53個(gè)科88個(gè)屬99個(gè)物種的鑒定，證實(shí)了ITS可用于鑒定屬間、種間、居群間等相對低分類等級的系統(tǒng)關(guān)系。朱英杰等[14]分別選擇psbA-trnH、葉綠體核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶大亞基（rbcL）、matK、rpoB、rpoC1及核ITS2序列作為DNA條形碼對重樓屬11個(gè)物種進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)ITS2的擴(kuò)增和測序效率均達(dá)100 %。借助ITS2序列能方便快捷地鑒定出大多數(shù)全草類中藥，如大青葉[15]、砂仁[16]、黨參[17]等。

2.2.2psbA-trnH序列與植物類中藥材鑒定psbA-trnH序列是被子植物葉綠體基因psbA與trnH之間的一段非編碼區(qū)，該區(qū)域進(jìn)化速度快，變異位點(diǎn)多，常用于植物屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育研究。Sun等[18]選擇psbA-trnH序列作為研究對象，對忍冬及其相關(guān)物種共44個(gè)樣本進(jìn)行檢測，其成功率高達(dá)100 %。有研究表明該條形碼可精準(zhǔn)、高效地鑒定枸杞屬植物、薯蕷屬、何首烏等各基原及其近緣物種[19-21]。由于psbA-trnH序列的測序成功率較高，該序列與其他序列組合作為DNA條形碼也能提高植物類藥材鑒定的準(zhǔn)確性與時(shí)效性。psbA-trnH與trnL-F形成組合序列可有效鑒別黑胡麻與多葉胡麻。psbA-trnH與matK、trnL-F形成組合序列可有效鑒別野菊與藥用野菊。

2.2.3 其他常用序列與植物類中藥材鑒定matK也是葉綠體基因中變化較大、進(jìn)化速度較快的序列，能在種屬水平上提供更多的進(jìn)化與發(fā)育信息，單獨(dú)或與其他序列組合均適用于植物類中藥材的分子鑒定。劉靜等[22]選擇matK序列作為DNA條形碼，快速、精準(zhǔn)地鑒定出了石斛屬12個(gè)物種的基原。研究發(fā)現(xiàn)該條形碼在白頭翁、高良姜、雞血藤與其混偽品的鑒定中都發(fā)揮了極大作用[23-25]。matK與psbA-trnH序列在豆蔻科中有顯著的差異，利用兩種條形碼組合對該科10個(gè)種的40個(gè)樣品進(jìn)行鑒定，有效率達(dá)95 %。rbcL序列同樣屬于葉綠體基因序列，該序列變異信息豐富，也是較為常用的中藥材鑒別條形碼。Newmaster等[26]對GenBank中rbcL序列進(jìn)行了詳細(xì)分析，研究發(fā)現(xiàn)其可鑒定出同屬物種的85 %，當(dāng)該序列與psbA-trnH序列組合測定時(shí)，對43科48屬96種的鑒定效率甚至能達(dá)到88 %。國際生命條形碼協(xié)會植物工作組也早已將rbcL和matK序列組合作為植物的條形碼序列。在我國基于rbcL序列的條形碼鑒定也已在浙貝母[27]、陽春砂[28]、紅景天[29]等中藥材鑒定中得到廣泛應(yīng)用。

2.3 DNA條形碼在動物類中藥材鑒定中的應(yīng)用

2.3.1 線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（COI）序列與動物類中藥材鑒定COI序列是一段長約650 bp的線粒體基因，該序列極易利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)又能保證足夠變異，其序列中幾乎不存在插入和缺失。利用COI序列對金錢百花蛇及其混偽品共4個(gè)種11份樣品進(jìn)行分析，相同的屬能明顯聚集在一起，且各物種又形成相對獨(dú)立的支，能與偽品明確區(qū)分開，該方法已被《中國藥典》[30]收載。杜鶴等[31]對鱉甲及其偽品8個(gè)種15份樣品的COI序列進(jìn)行研究，NJ樹顯示，5個(gè)正品樣本能明顯地聚集在一起，與偽品區(qū)分度較高。近年，基與COI序列的DNA條形碼，已廣泛應(yīng)用于熊膽粉[32]、蛤蟆油[33]、鹿茸粉[34]等名貴中藥材的鑒別。

2.3.2 線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytb）序列與動物類中藥材鑒定Cytb序列屬于線粒體基因，是一段具有豐富系統(tǒng)發(fā)育信息的較短DNA片段，所包含的遺傳信息適用于種間、屬間鑒定。羅暉明等[35]發(fā)現(xiàn)阿膠中驢源性物質(zhì)的Cytb基因可被酶切成長度為76 bp與314 bp的兩個(gè)片段，偽品無此酶切反應(yīng)，為其質(zhì)量控制提供了可靠的技術(shù)保障。王義權(quán)等[36]通過Cytb基因序列研究成功鑒定了金錢白花蛇、烏梢蛇等蛇類中藥材。另外，利用Cytb基因序列也可靈敏、準(zhǔn)確、高效地鑒定出燕窩[37]、林蛙油[38]、穿山甲[39]等藥材與營養(yǎng)品中摻偽現(xiàn)象。

2.3.3 rRNA條形碼與動物類中藥材鑒定 rRNA即核糖體RNA，在細(xì)胞內(nèi)含量較多，其相對分子質(zhì)量也較大，能在mRNA的指導(dǎo)下將氨基酸合成肽鏈?，F(xiàn)有較多的研究表明，rRNA序列條形碼適用于多種動物類中藥材的鑒定。劉忠權(quán)等[40]對中藥材龜甲與其混偽品18個(gè)種進(jìn)行線粒體12SrRNA基因序列測定，成功鑒別出所有偽品。白根本等[41]對11種鹿的鹿血與鹿茸進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，利用通用引物L(fēng)1091和H1478擴(kuò)增細(xì)胞線粒體12SrRNA基因片段，準(zhǔn)確區(qū)分出具有差異的種。12SrRNA基因片段也能快速、高效地鑒定出蛤蟆油[42]、塞隆骨[43]、烏賊[44]等動物類中藥材與其摻偽品。有些動物類中藥材可通過多種條形碼進(jìn)行鑒別與鑒定，但不同的條形碼之間鑒定的準(zhǔn)確性與靈敏度存在一定差異。

3 DNA條形碼等分子鑒定技術(shù)在中藥材鑒定中存在的問題

DNA條形碼等分子鑒定技術(shù)在中藥材鑒定方面比傳統(tǒng)鑒定方法有明顯的優(yōu)勢，當(dāng)然也存在一定的局限性。目前，條形碼選擇、DNA提取、序列測定等分子生物學(xué)方法在中藥材鑒定方面缺少相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，形成分子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范及確定對照序列或條形碼可減少其操作盲目性，也為實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)比對提供可靠依據(jù)。雖然現(xiàn)階段在2020年版《中國藥典》中已有對烏梢蛇、蘄蛇、川貝母、金錢白花蛇、霍山石斛的法定DNA分子鑒別方法，但相對于《中國藥典》所列的500多種常用動植物藥材來說數(shù)量還是極少的，仍需尋找特異的DNA分子探針，繼續(xù)完善相關(guān)品種的基因序列與條形碼。DNA條形碼等分子技術(shù)目前在動植物類藥材真?zhèn)舞b定中發(fā)揮了極大的作用，但從根本上評估中藥材的質(zhì)量仍有一定難度，如利用該技術(shù)很難區(qū)分出中藥材具體用藥部位；對于存儲、運(yùn)輸條件不當(dāng)，已發(fā)生霉變、褐變或由于放置時(shí)間過長，已出現(xiàn)大量細(xì)胞衰亡及DNA降解的中藥材，無法利用以上技術(shù)對指定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，也會大大限制其應(yīng)用，只能結(jié)合傳統(tǒng)方式來對藥材來源及藥用部位進(jìn)行準(zhǔn)確、全面的鑒定。

4 小結(jié)

DNA條形碼等分子鑒定技術(shù)借助其操作簡單、便捷，結(jié)果準(zhǔn)確、有效等優(yōu)勢，逐漸被廣泛應(yīng)用于中藥材鑒定工作中。借助此技術(shù)對正品道地產(chǎn)地藥材與非道地藥材進(jìn)行對比分析，搞清其遺傳結(jié)構(gòu)與分化水平，可為該藥材的鑒別、良種選育、種質(zhì)資源的利用提供遺傳資料。該技術(shù)的引入能在一定程度上緩解鑒定人才缺乏的現(xiàn)狀?？衫媚骋环N藥材的DNA條形碼，并結(jié)合該藥材的產(chǎn)區(qū)、種植基地、生長年限、采收年份等信息，按設(shè)定的編碼規(guī)則編譯成二維碼。這種方式能提高對中藥材生產(chǎn)及流通管理的有效性，使中藥材質(zhì)量控制體系不斷完善。