劉艷平，張秀花

（菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274032）

尼莫地平注射液為鈣離子拮抗劑，具有抗缺血和抗血管收縮作用[1]，2005年首次載入《中國(guó)藥典》，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)下仍保留熱原檢查項(xiàng)目[2]。尼莫地平注射液進(jìn)行熱原試驗(yàn)時(shí)，經(jīng)常引起試驗(yàn)兔體溫異常下降現(xiàn)象，必須反復(fù)重試，消耗大量人力、物力[3]，且易導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果假陰性，臨床用藥存在較大的安全隱患。近年，關(guān)于尼莫地平注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究甚少。凝膠法為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的經(jīng)典方法，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，干擾因素少，結(jié)果重現(xiàn)性好，替代熱原檢查法成為必然。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；可調(diào)微量移液器（規(guī)格：20～200 μl，100～1000 μl，賽默飛）。

1.2 材料

鱟試劑[TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1908012，靈敏度（λ）為0.125 EU/ml；批號(hào)1907081，λ為0.25 EU/ml；規(guī)格均為0.1 ml/支]；TAL（福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：19090812，λ為0.125 EU/ml；批號(hào)：19061612，λ為0.25 EU/ml；規(guī)格均為0.1 ml/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-202088，規(guī)格：60 EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司，批號(hào)：1912241，規(guī)格：10 ml/支）；尼莫地平注射液（批號(hào)：2012196，20041164，200616，規(guī)格：100 ml:20 mg，均由委托單位提供）。無(wú)熱原吸頭（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1912241，規(guī)格：250 μl；批號(hào)：2001063，規(guī)格：1000 μl）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAL λ復(fù)核

取TAL 4批，每批18支，分別加BET水0.1 ml溶解；取CSE 1支，用1.0 ml BET水溶解后，在旋渦混合器上混勻15 min，制備2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與等體積的鱟試劑溶液混合，每一內(nèi)毒素濃度平行做4管；其余2管加入等體積的BET水作為陰性對(duì)照，依法檢查[4]，并計(jì)算TAL靈敏度測(cè)定值（λc）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 TALλ復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，λc均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）范圍內(nèi)，表明復(fù)核結(jié)果符合規(guī)定，4批鱟試劑均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）確定

根據(jù)公式L=K/M[4]，注射劑K=5 EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，臨床用量為100 ml，qd，人均體重按60 kg計(jì)算，則L=5/(100/60)=3 EU/ml。根據(jù)注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則[4]，為確保臨床用藥安全，本試驗(yàn)細(xì)菌內(nèi)毒素限值設(shè)定至計(jì)算值的1/3，即1 EU/ml。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）確定

目前市售TALλ一般在0.5～0.03 EU/ml之間，最大有效稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ，其中C為供試品溶液的濃度，C=1.0 ml/ml。經(jīng)計(jì)算，MVD分別為2，4，8，16，32倍。

2.4 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)

取TAL 2批，每批34支，分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批，分別用BET水稀釋2，4，8，16，32倍，每個(gè)濃度2管，標(biāo)記為供試品陰性對(duì)照（NPC）系列。取CSE 1支，用BET水1.0 ml溶解，在旋渦混合器上混勻15 min后，用上述NPC系列作稀釋劑，制備2λ供試品溶液，每個(gè)濃度2管，標(biāo)記為供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）系列，同時(shí)設(shè)置細(xì)菌內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照（PC）和BET水陰性對(duì)照（NC），每個(gè)系列各2管，依法檢查，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 尼莫地平注射液干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，NC均為陰性，PC均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。NPC均為陰性，8倍稀釋液對(duì)TAL均無(wú)干擾作用。

2.5 正式干擾試驗(yàn)

取TAL 2批，每批66支，分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批，分別用BET水稀釋8倍。取CSE 1支，分別用BET水和8倍稀釋液制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的BET水系列和供試液系列，每一濃度4管；其余2管加BET水作陰性對(duì)照，依法檢查，分別計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值Es、Et。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 尼莫地平注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，Es均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）之間，且Et均在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）之間，試驗(yàn)結(jié)果符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定，說(shuō)明供試品在該濃度下無(wú)干擾作用[5]。

2.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，取供試品3批，用BET水稀釋8倍后，分別采用兩個(gè)廠家λ均為0.125 EU/ml的TAL依法檢查，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 尼莫地平注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

由表4可知，PC均為陽(yáng)性，NC均為陰性，PPC均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。供試品管均為陰性，表明3批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定[4]。

3 討論

尼莫地平注射液為幾乎無(wú)色的澄明液體，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定pH值為5.5～7.5[2]。鱟試劑最適反應(yīng)pH值為6.0～8.0，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)對(duì)試驗(yàn)起干擾作用[6]。經(jīng)測(cè)定，本品pH值為6.6，不需要進(jìn)行酸堿性調(diào)節(jié)，稀釋法可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

干擾試驗(yàn)的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和TAL的反應(yīng)不存在干擾作用，可以使用較低靈敏度的TAL進(jìn)行干擾試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，正式干擾試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)盡量選擇不干擾稀釋倍數(shù)或濃度對(duì)應(yīng)靈敏度的TAL進(jìn)行試驗(yàn)[5]。由表2可見(jiàn)，稀釋倍數(shù)相同的樣品，對(duì)TAL的干擾作用不同。4倍稀釋液對(duì)一批TAL有干擾作用，而對(duì)另一批TAL無(wú)干擾作用，8倍稀釋液對(duì)兩批TAL均無(wú)干擾作用。MVD為8倍時(shí)對(duì)應(yīng)TAL的靈敏度為0.125 EU/ml，故本試驗(yàn)選用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試TAL劑進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)，結(jié)果符合要求。

熱原檢查法檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，干擾因素多，檢驗(yàn)成本高，終將被細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用十分廣泛的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，被世界各國(guó)藥典所收載[7-8]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法已應(yīng)用于500多種藥品或原料藥[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，尼莫地平注射液用BET水稀釋8倍時(shí)，對(duì)靈敏度≥0.125 EU/ml的鱟試劑無(wú)干擾作用，采用L為1.0 EU/ml進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的，可用于原料及制劑的質(zhì)量控制。