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        尼莫地平注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的探討

        2022-08-08 03:29:24劉艷平張秀花
        食品與藥品 2022年4期
        關(guān)鍵詞:檢查法尼莫地平內(nèi)毒素

        劉艷平,張秀花

        (菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院,山東 菏澤 274032)

        尼莫地平注射液為鈣離子拮抗劑,具有抗缺血和抗血管收縮作用[1],2005年首次載入《中國藥典》,現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項下仍保留熱原檢查項目[2]。尼莫地平注射液進行熱原試驗時,經(jīng)常引起試驗兔體溫異常下降現(xiàn)象,必須反復(fù)重試,消耗大量人力、物力[3],且易導(dǎo)致試驗結(jié)果假陰性,臨床用藥存在較大的安全隱患。近年,關(guān)于尼莫地平注射液細菌內(nèi)毒素檢查方法的研究甚少。凝膠法為細菌內(nèi)毒素檢查的經(jīng)典方法,操作簡單,靈敏度高,干擾因素少,結(jié)果重現(xiàn)性好,替代熱原檢查法成為必然。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        TAL-40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司);ZH-2型自動漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠);可調(diào)微量移液器(規(guī)格:20~200 μl,100~1000 μl,賽默飛)。

        1.2 材料

        鱟試劑[TAL,湛江安度斯生物有限公司,批號:1908012,靈敏度(λ)為0.125 EU/ml;批號1907081,λ為0.25 EU/ml;規(guī)格均為0.1 ml/支];TAL(福州新北生化工業(yè)有限公司,批號:19090812,λ為0.125 EU/ml;批號:19061612,λ為0.25 EU/ml;規(guī)格均為0.1 ml/支);細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE,中國食品藥品檢定研究院,批號:150601-202088,規(guī)格:60 EU/支);細菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水,廈門鱟試劑生物科技股份有限公司,批號:1912241,規(guī)格:10 ml/支);尼莫地平注射液(批號:2012196,20041164,200616,規(guī)格:100 ml:20 mg,均由委托單位提供)。無熱原吸頭(湛江安度斯生物有限公司,批號:1912241,規(guī)格:250 μl;批號:2001063,規(guī)格:1000 μl)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 TAL λ復(fù)核

        取TAL 4批,每批18支,分別加BET水0.1 ml溶解;取CSE 1支,用1.0 ml BET水溶解后,在旋渦混合器上混勻15 min,制備2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別與等體積的鱟試劑溶液混合,每一內(nèi)毒素濃度平行做4管;其余2管加入等體積的BET水作為陰性對照,依法檢查[4],并計算TAL靈敏度測定值(λc)。結(jié)果見表1。

        表1 TALλ復(fù)核試驗結(jié)果

        由表1可知,λc均在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)范圍內(nèi),表明復(fù)核結(jié)果符合規(guī)定,4批鱟試劑均可用于細菌內(nèi)毒素檢查。

        2.2 細菌內(nèi)毒素限值(L)確定

        根據(jù)公式L=K/M[4],注射劑K=5 EU/(kg·h);M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量,臨床用量為100 ml,qd,人均體重按60 kg計算,則L=5/(100/60)=3 EU/ml。根據(jù)注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則[4],為確保臨床用藥安全,本試驗細菌內(nèi)毒素限值設(shè)定至計算值的1/3,即1 EU/ml。

        2.3 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)確定

        目前市售TALλ一般在0.5~0.03 EU/ml之間,最大有效稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ,其中C為供試品溶液的濃度,C=1.0 ml/ml。經(jīng)計算,MVD分別為2,4,8,16,32倍。

        2.4 干擾預(yù)實驗

        取TAL 2批,每批34支,分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批,分別用BET水稀釋2,4,8,16,32倍,每個濃度2管,標(biāo)記為供試品陰性對照(NPC)系列。取CSE 1支,用BET水1.0 ml溶解,在旋渦混合器上混勻15 min后,用上述NPC系列作稀釋劑,制備2λ供試品溶液,每個濃度2管,標(biāo)記為供試品陽性對照(PPC)系列,同時設(shè)置細菌內(nèi)毒素陽性對照(PC)和BET水陰性對照(NC),每個系列各2管,依法檢查,結(jié)果見表2。

        表2 尼莫地平注射液干擾預(yù)實驗結(jié)果

        由表2可知,NC均為陰性,PC均為陽性,試驗有效。NPC均為陰性,8倍稀釋液對TAL均無干擾作用。

        2.5 正式干擾試驗

        取TAL 2批,每批66支,分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批,分別用BET水稀釋8倍。取CSE 1支,分別用BET水和8倍稀釋液制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的BET水系列和供試液系列,每一濃度4管;其余2管加BET水作陰性對照,依法檢查,分別計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Es、Et。結(jié)果見表3。

        表3 尼莫地平注射液干擾試驗結(jié)果

        由表3可知,Es均在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)之間,且Et均在0.5Es~2Es(包括0.5Es和2Es)之間,試驗結(jié)果符合細菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定,說明供試品在該濃度下無干擾作用[5]。

        2.6 細菌內(nèi)毒素檢查

        根據(jù)干擾試驗結(jié)果,取供試品3批,用BET水稀釋8倍后,分別采用兩個廠家λ均為0.125 EU/ml的TAL依法檢查,結(jié)果見表4。

        表4 尼莫地平注射液細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

        由表4可知,PC均為陽性,NC均為陰性,PPC均為陽性,試驗有效。供試品管均為陰性,表明3批樣品細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定[4]。

        3 討論

        尼莫地平注射液為幾乎無色的澄明液體,標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定pH值為5.5~7.5[2]。鱟試劑最適反應(yīng)pH值為6.0~8.0,過酸或過堿會對試驗起干擾作用[6]。經(jīng)測定,本品pH值為6.6,不需要進行酸堿性調(diào)節(jié),稀釋法可用于細菌內(nèi)毒素檢查。

        干擾試驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和TAL的反應(yīng)不存在干擾作用,可以使用較低靈敏度的TAL進行干擾試驗的預(yù)實驗,正式干擾試驗時,應(yīng)盡量選擇不干擾稀釋倍數(shù)或濃度對應(yīng)靈敏度的TAL進行試驗[5]。由表2可見,稀釋倍數(shù)相同的樣品,對TAL的干擾作用不同。4倍稀釋液對一批TAL有干擾作用,而對另一批TAL無干擾作用,8倍稀釋液對兩批TAL均無干擾作用。MVD為8倍時對應(yīng)TAL的靈敏度為0.125 EU/ml,故本試驗選用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試TAL劑進行正式干擾試驗,結(jié)果符合要求。

        熱原檢查法檢驗周期長,干擾因素多,檢驗成本高,終將被細菌內(nèi)毒素檢查法替代。細菌內(nèi)毒素檢查法是藥品檢驗中應(yīng)用十分廣泛的一項檢測技術(shù),被世界各國藥典所收載[7-8]。細菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法已應(yīng)用于500多種藥品或原料藥[9]。本試驗結(jié)果表明,尼莫地平注射液用BET水稀釋8倍時,對靈敏度≥0.125 EU/ml的鱟試劑無干擾作用,采用L為1.0 EU/ml進行細菌內(nèi)毒素檢查是可行的,可用于原料及制劑的質(zhì)量控制。

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