劉艷平,張秀花
(菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,山東 菏澤 274032)
尼莫地平注射液為鈣離子拮抗劑,具有抗缺血和抗血管收縮作用[1],2005年首次載入《中國(guó)藥典》,現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)下仍保留熱原檢查項(xiàng)目[2]。尼莫地平注射液進(jìn)行熱原試驗(yàn)時(shí),經(jīng)常引起試驗(yàn)兔體溫異常下降現(xiàn)象,必須反復(fù)重試,消耗大量人力、物力[3],且易導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果假陰性,臨床用藥存在較大的安全隱患。近年,關(guān)于尼莫地平注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究甚少。凝膠法為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的經(jīng)典方法,操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,干擾因素少,結(jié)果重現(xiàn)性好,替代熱原檢查法成為必然。
TAL-40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司);ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠);可調(diào)微量移液器(規(guī)格:20~200 μl,100~1000 μl,賽默飛)。
鱟試劑[TAL,湛江安度斯生物有限公司,批號(hào):1908012,靈敏度(λ)為0.125 EU/ml;批號(hào)1907081,λ為0.25 EU/ml;規(guī)格均為0.1 ml/支];TAL(福州新北生化工業(yè)有限公司,批號(hào):19090812,λ為0.125 EU/ml;批號(hào):19061612,λ為0.25 EU/ml;規(guī)格均為0.1 ml/支);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE,中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):150601-202088,規(guī)格:60 EU/支);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水,廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司,批號(hào):1912241,規(guī)格:10 ml/支);尼莫地平注射液(批號(hào):2012196,20041164,200616,規(guī)格:100 ml:20 mg,均由委托單位提供)。無(wú)熱原吸頭(湛江安度斯生物有限公司,批號(hào):1912241,規(guī)格:250 μl;批號(hào):2001063,規(guī)格:1000 μl)。
取TAL 4批,每批18支,分別加BET水0.1 ml溶解;取CSE 1支,用1.0 ml BET水溶解后,在旋渦混合器上混勻15 min,制備2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別與等體積的鱟試劑溶液混合,每一內(nèi)毒素濃度平行做4管;其余2管加入等體積的BET水作為陰性對(duì)照,依法檢查[4],并計(jì)算TAL靈敏度測(cè)定值(λc)。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 TALλ復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果
由表1可知,λc均在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)范圍內(nèi),表明復(fù)核結(jié)果符合規(guī)定,4批鱟試劑均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。
根據(jù)公式L=K/M[4],注射劑K=5 EU/(kg·h);M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量,臨床用量為100 ml,qd,人均體重按60 kg計(jì)算,則L=5/(100/60)=3 EU/ml。根據(jù)注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則[4],為確保臨床用藥安全,本試驗(yàn)細(xì)菌內(nèi)毒素限值設(shè)定至計(jì)算值的1/3,即1 EU/ml。
目前市售TALλ一般在0.5~0.03 EU/ml之間,最大有效稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ,其中C為供試品溶液的濃度,C=1.0 ml/ml。經(jīng)計(jì)算,MVD分別為2,4,8,16,32倍。
取TAL 2批,每批34支,分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批,分別用BET水稀釋2,4,8,16,32倍,每個(gè)濃度2管,標(biāo)記為供試品陰性對(duì)照(NPC)系列。取CSE 1支,用BET水1.0 ml溶解,在旋渦混合器上混勻15 min后,用上述NPC系列作稀釋劑,制備2λ供試品溶液,每個(gè)濃度2管,標(biāo)記為供試品陽(yáng)性對(duì)照(PPC)系列,同時(shí)設(shè)置細(xì)菌內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照(PC)和BET水陰性對(duì)照(NC),每個(gè)系列各2管,依法檢查,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 尼莫地平注射液干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表2可知,NC均為陰性,PC均為陽(yáng)性,試驗(yàn)有效。NPC均為陰性,8倍稀釋液對(duì)TAL均無(wú)干擾作用。
取TAL 2批,每批66支,分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批,分別用BET水稀釋8倍。取CSE 1支,分別用BET水和8倍稀釋液制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的BET水系列和供試液系列,每一濃度4管;其余2管加BET水作陰性對(duì)照,依法檢查,分別計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值Es、Et。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 尼莫地平注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果
由表3可知,Es均在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)之間,且Et均在0.5Es~2Es(包括0.5Es和2Es)之間,試驗(yàn)結(jié)果符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定,說(shuō)明供試品在該濃度下無(wú)干擾作用[5]。
根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果,取供試品3批,用BET水稀釋8倍后,分別采用兩個(gè)廠家λ均為0.125 EU/ml的TAL依法檢查,結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 尼莫地平注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果
由表4可知,PC均為陽(yáng)性,NC均為陰性,PPC均為陽(yáng)性,試驗(yàn)有效。供試品管均為陰性,表明3批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定[4]。
尼莫地平注射液為幾乎無(wú)色的澄明液體,標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定pH值為5.5~7.5[2]。鱟試劑最適反應(yīng)pH值為6.0~8.0,過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)對(duì)試驗(yàn)起干擾作用[6]。經(jīng)測(cè)定,本品pH值為6.6,不需要進(jìn)行酸堿性調(diào)節(jié),稀釋法可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。
干擾試驗(yàn)的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和TAL的反應(yīng)不存在干擾作用,可以使用較低靈敏度的TAL進(jìn)行干擾試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn),正式干擾試驗(yàn)時(shí),應(yīng)盡量選擇不干擾稀釋倍數(shù)或濃度對(duì)應(yīng)靈敏度的TAL進(jìn)行試驗(yàn)[5]。由表2可見(jiàn),稀釋倍數(shù)相同的樣品,對(duì)TAL的干擾作用不同。4倍稀釋液對(duì)一批TAL有干擾作用,而對(duì)另一批TAL無(wú)干擾作用,8倍稀釋液對(duì)兩批TAL均無(wú)干擾作用。MVD為8倍時(shí)對(duì)應(yīng)TAL的靈敏度為0.125 EU/ml,故本試驗(yàn)選用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試TAL劑進(jìn)行正式干擾試驗(yàn),結(jié)果符合要求。
熱原檢查法檢驗(yàn)周期長(zhǎng),干擾因素多,檢驗(yàn)成本高,終將被細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用十分廣泛的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù),被世界各國(guó)藥典所收載[7-8]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法已應(yīng)用于500多種藥品或原料藥[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,尼莫地平注射液用BET水稀釋8倍時(shí),對(duì)靈敏度≥0.125 EU/ml的鱟試劑無(wú)干擾作用,采用L為1.0 EU/ml進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的,可用于原料及制劑的質(zhì)量控制。