王 磊 孫雪晴 周 晶

（1 東營市水務(wù)事業(yè)發(fā)展中心，山東東營 257091；2 曲阜師范大學(xué)，山東曲阜 273165）

南四湖是山東省內(nèi)最大的淡水湖， 同時(shí)也是南水北調(diào)東線山東段主要調(diào)蓄水庫， 是山東省重要的水源地。沿湖地區(qū)污染排放及湖內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖、航運(yùn)等活動(dòng)嚴(yán)重影響水質(zhì)， 關(guān)乎沿湖居民的飲用水安全和南水北調(diào)東線的用水安全[1]。 近年來，南四湖的水體污染備受關(guān)注， 水體富營養(yǎng)化程度日趨嚴(yán)重。2010—2011 年枯水期期間， 南四湖湖區(qū)水位下降，水體溶解氧水平提高，總氮含量有所下降，說明該湖區(qū)的好氧反硝化細(xì)菌有較高效的反硝化作用[2]。 因此，對(duì)南四湖中的好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行分離純化、篩選及鑒定， 即可得到具有高效反硝化作用的好氧反硝化細(xì)菌菌株， 并且通過對(duì)南四湖中好氧反硝化細(xì)菌的分離篩選及研究， 能較準(zhǔn)確地了解南四湖水體富營養(yǎng)化程度， 為今后降低其水體富營養(yǎng)化提供生物學(xué)方向的啟示。

19 世紀(jì)80 年代人類首次分離出反硝化細(xì)菌，隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種兼性厭氧的反硝化細(xì)菌[3]，例如丙酸桿菌屬、克雷伯氏菌、螺旋菌屬等。 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及發(fā)展，又發(fā)現(xiàn)了多種好氧反硝化細(xì)菌（逾50 個(gè)屬130 個(gè)種），例如假單胞菌屬[4]、施氏假單胞菌[5]、產(chǎn)黃桿菌[6]、無色桿菌屬[7]、嗜堿副球菌[8]、副球菌屬[9]等。目前，好氧反硝化細(xì)菌成為研究熱點(diǎn)，人們重點(diǎn)關(guān)注好氧反硝化細(xì)菌的脫氮能力及在實(shí)際中的應(yīng)用。反硝化細(xì)菌可以把電子傳遞給氧氣，同時(shí)也能在硝酸還原酶的作用下傳遞給硝酸根[10]。 學(xué)者們也越來越多地將反硝化細(xì)菌與污水處理相結(jié)合， 并已經(jīng)取得重大成果。反硝化細(xì)菌與水生態(tài)、水環(huán)境相結(jié)合的研究方向逐漸被關(guān)注， 并成為近年來人們的研究重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1富集培養(yǎng)基。 NaNO30.85 g/L， 琥珀酸鈉2.84 g/L，KH2PO41.36 g/L，MgSO4·7H2O 0.19 g/L，（NH4）2SO40.27 g/L， 酵母提取物1 g/L。 微量元素：FeSO4·7H2O 0.2 g/L，CoCl2·7H2O 1 g/L，Na2MoO4·7H2O 0.38 g/L，CaCl20.2 g/L，pH 值7.2[8]。

1.1.2分 離 培 養(yǎng) 基。 KNO31 g/L，KH2PO41 g/L，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.5 g/L，CaCl2·7H2O 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，琥珀酸鈉8.5 g/L，溴百里香酚藍(lán)1%，乙醇溶液1‰，瓊脂15 g/L，pH 值7.0~7.3[9-10]。

1.1.3反硝化培養(yǎng)基。 KNO30.6 g/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L， 檸檬酸鈉5 g/L，pH 值7.0[11]。

1.1.4LB 培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1南四湖養(yǎng)殖水體的取樣。 選取南四湖河蟹圍網(wǎng)養(yǎng)殖區(qū)作為采樣區(qū)[12-13]，采用五點(diǎn)采樣法在河蟹圍網(wǎng)養(yǎng)殖區(qū)采樣。取樣后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，并將其放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將分離菌株接種在反硝化液體培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩， 即吸取培養(yǎng)液將其滴在干凈的白瓷板上，加入Griess 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ，觀察結(jié)果。若結(jié)果呈現(xiàn)紅色， 則可證明含有亞硝態(tài)氮； 若顯示無色， 且在加入二苯胺-硫酸試劑后生成了藍(lán)色的沉淀，則可以證明含有硝態(tài)氮；若加入二苯胺-硫酸試劑后溶液依舊顯示無色， 則證明無亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的存在。

1.2.2反硝化菌株的鑒定。 生理生化鑒定參照常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[5]。 用于16S rRNA 反應(yīng)的引物為通用引物，正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′），反向引物為1492R（5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′）[14]。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性35 s；56 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物由青島派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中采用序列比對(duì)并構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

由圖1 可知， 經(jīng)篩選后的菌株S-5 在培養(yǎng)皿上的菌落呈現(xiàn)為微黃色，菌落表面濕潤粗糙不透明，經(jīng)革蘭氏染色后顯示為陽性。其細(xì)胞形態(tài)顯示為桿狀，有周生鞭毛。

2.2 分子生物學(xué)特征

經(jīng)過PCR 擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳后，得到菌株16S rDNA 序列的電泳圖如圖2 所示，其中，圖片所顯示的第5 列為目標(biāo)菌株S-5 的結(jié)果， 除第1 列為Marker 外，其他均為對(duì)照。 在本試驗(yàn)中，所需目的片段大小約為1 500 bp。 之后經(jīng)過測(cè)序可以得知，該片段的大小為1 422 bp。

將測(cè)序結(jié)果在NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)后得知，目標(biāo)菌株的序列跟蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的序列相似性極高，為99.93%，且與芽孢桿菌屬中的3 株序列相似度達(dá)到了100%，這3 株序列的基因序號(hào)分別為MG787231.1、MK445142.1 以及KY312798.1。挑選序列相似度較高的菌株運(yùn)用MEGA 6.1 軟件，采用鄰接法（neighbour-joining）制作系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，其結(jié)果如圖3 所示。 結(jié)合形態(tài)學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果分析， 基本可以判定篩選出的菌株屬于芽孢桿菌屬，為蠟樣芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

從南四湖養(yǎng)殖水體采樣， 采用富集培養(yǎng)得到反硝化細(xì)菌， 通過形態(tài)學(xué)觀察、16S rRNA 基因序列分析及同源性比對(duì)，初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬，為蠟樣芽孢桿菌。

3.2 討論

近年來， 南四湖水體富營養(yǎng)化雖然處于較高水平，但較前幾年有了極大程度的降低，南四湖水產(chǎn)養(yǎng)殖戶也有投放益生菌的行為。因此，南四湖水體中可能含有大量的反硝化細(xì)菌， 通過對(duì)養(yǎng)殖水體中反硝化細(xì)菌的研究， 可得到后期解決南四湖富營養(yǎng)化的生物學(xué)方法。

本研究發(fā)現(xiàn)南四湖養(yǎng)殖水體中的反硝化細(xì)菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），屬于芽孢桿菌屬。經(jīng)調(diào)查，南四湖區(qū)域應(yīng)用的水產(chǎn)益生菌均為枯草芽孢桿菌，而蠟樣芽孢桿菌致病性較強(qiáng)，可以從人工益生菌菌種中排除。反硝化細(xì)菌多在厭氧條件下生存，而芽孢桿菌屬多在有氧或兼性厭氧的條件下生存， 該菌株的發(fā)現(xiàn)為南四湖富營養(yǎng)化水平的降低提供了一種好氧反硝化細(xì)菌的操作方式， 也為今后南四湖地區(qū)好氧反硝化細(xì)菌菌種篩選提供了一系列經(jīng)驗(yàn)。Gatesoupe[15]研究表明，蠟樣芽孢桿菌進(jìn)入宿主體內(nèi)能夠迅速定殖，并可通過分泌蛋白酶和淀粉酶等大分子物質(zhì)提高宿主的消化機(jī)能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。 孫 娜等[16]研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌具有產(chǎn)淀粉酶的特性， 試驗(yàn)組大菱鲆幼魚腸道內(nèi)消化酶活力的提高可能與該菌定殖于幼魚腸道后分泌的胞外酶有關(guān)，其中淀粉酶、蛋白酶等胞外酶能夠協(xié)助機(jī)體消化營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)飼料中營養(yǎng)素的降解，提高飼料利用率。 崔廣鑫等[17]研究也表明，蠟樣芽孢桿菌對(duì)大菱鲆幼魚體內(nèi)的抗氧化能力產(chǎn)生了積極影響。綜上所述，蠟樣芽孢桿菌有利于促進(jìn)高等水生生物生長、 維持水體浮游生物生態(tài)平衡。

本研究確認(rèn)了南四湖養(yǎng)殖水體中存在芽孢桿菌屬，芽孢桿菌屬是解磷菌的重要菌種，國內(nèi)研究解磷菌已有100 多年歷史。 Zeeuw[18]發(fā)現(xiàn)，某些難溶性的復(fù)合物施入土壤可作為磷源。 1948 年，Gerretsen[19]發(fā)現(xiàn)植物施不溶性磷肥，接種土壤微生物后，有利于磷吸收，從而促進(jìn)植株生長。 有學(xué)者從土壤中分離出一種解磷巨大芽孢桿菌（B. megateriumvar.phosphaticum），其能分解核酸、卵磷脂，可提高土壤有效磷含量[20]。 尹瑞齡[21]從土壤中分離出265 株細(xì)菌，并測(cè)定了其溶解摩納哥磷礦粉的能力，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)6 d 后，溶磷能力平均為2~30 mg/g，其中巨大芽孢桿菌、節(jié)桿菌、黃桿菌、歐文氏菌及假單胞桿菌解磷能力很強(qiáng)，達(dá)到25~30 mg/g。 Paul 等[22]發(fā)現(xiàn)，從豆科植物根際分離的幾株芽孢桿菌溶解磷酸三鈣效率較高，達(dá)18%。 陸洪省等[23]從黃河三角洲鹽土中分離純化了1 株具有高效解磷能力的菌株， 屬于芽孢桿菌屬， 與Bacillus thuringiensis同源性達(dá)98%。李 輝等[24]從蚯蚓糞分離篩選到7 株有解磷效果的菌株，短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）解磷能力最強(qiáng)。 魏烈群等[25]從榮成天鵝湖沉積物中篩選出10 株有機(jī)解磷菌，溶磷圈直徑比為1.05~4.11，均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。 羅利均[26]通過紫外線—氯化鋰誘導(dǎo)水體中采集的蠟狀芽孢桿菌，變異篩選后活性磷濃度提高了29.3%， 磷酸鈣發(fā)酵液中活性磷濃度提高了28.0%， 焦磷酸鈣發(fā)酵液中活性磷提高了26.5%，同時(shí)變異菌產(chǎn)有機(jī)酸能力與植酸酶活性增強(qiáng)。

近10 年來，國內(nèi)外研究表明，蠟樣芽孢桿菌對(duì)重金屬鉻、鎘、鉛的耐受能力極強(qiáng)，變異菌株對(duì)重金屬離子還原、吸附具有較強(qiáng)的能力。黃飛[27]研究表明，在重金屬復(fù)合污染水體，Cu、Zn、Cd 和Pb 最高超標(biāo)倍數(shù)分別達(dá)6 倍、20 倍、35 倍和3 倍，Cd 離子濃度高達(dá)150 mg/L 時(shí)蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）仍然可以生長。陳志[28]從鉻渣中分離的蠟狀芽孢桿菌具有耐受和還原Cr6+態(tài)離子團(tuán)能力， 其細(xì)胞碎片和胞外分泌物都具有還原活性。另外，還證實(shí)了蠟狀芽孢桿菌胞外分泌物能夠與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)配位Cr3+離子。 李 輝等[29]從沈陽受鎘污染土壤中篩選出高耐鎘性蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），能夠有效吸附Cd2+，且靜電吸附、離子交換作用、表面配合作用是主要吸附機(jī)制。

本研究中， 經(jīng)過一系列篩選分離操作得到的菌株在序列比對(duì)后， 發(fā)現(xiàn)與其他在含重金屬錳的環(huán)境下分離出的菌株序列相似性極高， 表明該菌有很好的反硝化潛力， 這為蠟樣芽孢桿菌的應(yīng)用提供了新思路和新方向。因此，推測(cè)該菌株也有可能具有高抗錳的特性，與文獻(xiàn)提到的蠟狀芽孢桿菌高抗鎘、鉻特性相符， 為今后降低重金屬地區(qū)富營養(yǎng)程度提供了研究思路， 并且為南四湖地區(qū)環(huán)境污染的防治提供了生物學(xué)方法。 南四湖水體及沉積物的芽孢桿菌屬的反硝化能力、解磷能力以及芽孢桿菌生長對(duì)水體可溶性磷含量變化、C/P 值變化、藻類生長的影響都未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。