高晶晶，劉麗娜，王 震，閆君芝，慕 苗，陳錦中

(榆林學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000)

豆渣是生產(chǎn)豆腐或豆制品過(guò)程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品[1]。經(jīng)研究表明，大豆中有很大一部分營(yíng)養(yǎng)成分殘留在豆渣中，其含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、纖維、維生素、礦物質(zhì)、功能性低聚糖等營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]。中國(guó)是豆腐生產(chǎn)的發(fā)源地，豆腐的生產(chǎn)、銷售量都較大，相應(yīng)的豆渣產(chǎn)量也很大[4]。然而豆渣卻常被人們當(dāng)食物殘?jiān)拥艋蛘咦鳛轱暳希⒉荒芡癸@出豆渣自身所含有的價(jià)值，還會(huì)造成資源的浪費(fèi)，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的影響[5]。豆渣功能性低聚糖對(duì)人體有很多的好處，如促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖[6]、保護(hù)肝臟、抑制體內(nèi)腐敗物質(zhì)的生成[7]、輔助降低血壓功效[8]、降低血清膽固醇[9]、清潔腸道，緩解便秘[10]、治療肝炎和肝硬化[11]、益于胃腸健康、促進(jìn)腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生成和吸收[12]、抑制有害物生成等[13]。

作者以豆渣為研究對(duì)象，對(duì)其中的功能性低聚糖進(jìn)行提取研究，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了豆渣中功能性低聚糖的提取工藝路線，為其后續(xù)應(yīng)用研究提供了一定理論基礎(chǔ)[14]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

豆渣：榆林學(xué)院西門豆腐坊。

正己烷：山東利昂新材料科技有限公司；無(wú)水乙醇：成都市六順精細(xì)化工有限公司；苯酚：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：上海金穗生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸：上海凱賽化工有限公司；蒽酮：上海天蓮精細(xì)化工有限公司；以上試劑均為分析純。

電子天平：FA1004，上海良平儀器儀表有限公司；可見分光光度計(jì)：723N，上海佑科儀器儀表有限公司；粉碎機(jī)：200 g，浙江省上虞市大亨橋儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋；HH-1，金壇市丹陽(yáng)門石英玻璃廠；鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9030A，上海皓莊儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.1.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

量取低聚糖提取液1 mL至1支干凈的25 mL比色管中，然后向其中加入3 mL的3,5-二硝基水楊酸溶液，快速搖勻，放置燒開的水中6 min，取出，立即放入冷水中冷卻，后加入蒸餾水稀釋至刻度線，靜放5 min，用蒸餾水代替樣品溶液作空白試劑，用1 cm比色皿在分光光度計(jì)上最大波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出還原糖含量[15]。

1.2.1.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取蒸餾水和提取液各2 mL，分別放入2支干凈的比色管中，后向其中各加入10 mL的蒽酮溶液，快速搖勻，放進(jìn)燒水鍋中加熱10 min取出，立即放入冷水涼至室溫，用1 cm比色皿在可見分光光度計(jì)上于最大波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出總糖含量[16]。

1.2.2 提取率的計(jì)算[17]

低聚糖提取率=(總糖提取率-還原糖提取率)×100%

式中：ρ為還原糖或總糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為總糖或還原糖提取液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 豆渣脫脂

取新鮮剛購(gòu)買的豆渣，用新紗布包裹擠去豆渣中多余的水分，散開鋪放在干凈的盤子里，晾曬至質(zhì)量恒定。后將其放入粉碎機(jī)中粉碎后過(guò)孔徑178 μm篩，裝入準(zhǔn)備好的袋子，密封保存?zhèn)溆肹18]。

準(zhǔn)確稱取20 g的豆渣粉末過(guò)孔徑為178 μm篩，倒進(jìn)三口燒瓶中，向其中加入30 mL正己烷溶液，快速搖晃均勻，封住瓶口，放至50 ℃的數(shù)顯恒溫水浴鍋中，插入冷凝管，浸提2 h后將所得溶液進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾后豆渣放置干燥箱中40 ℃干燥1 h，即為脫脂豆渣粉末[19]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10 g脫脂后的豆渣，置于三口燒瓶中，加入一定φ(乙醇)的溶液，在一定溫度的恒溫水浴下攪拌，提取一定時(shí)間后，過(guò)濾，取上清液，用3,5-二硝基水楊酸法和蒽酮法分別檢測(cè)還原糖和總糖的含量，然后計(jì)算出功能性低聚糖的含量及提取率。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

利用響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析得到最佳的工藝條件。在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間(A)、φ(乙醇)(B)、提取溫度(C)，對(duì)提取率影響較大的因素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，水平因素設(shè)計(jì)見表1。

表1 設(shè)計(jì)因素與水平編碼表

2 結(jié)果與討論

2.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以ρ(葡萄糖)-吸光度作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

ρ(葡萄糖)/(mg·mL-1)圖1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

ρ(葡萄糖)/(mg·mL-1)圖2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各影響因素對(duì)豆渣低聚糖提取率的影響見圖3。由圖3a可知，t=1.0～2.5 h，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，豆渣功能性低聚糖的提取率顯著增加，t=2.5 h，豆渣低聚糖提取率達(dá)到最高，而t=2.5～3.0 h，低聚糖的提取率反而下降，可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致部分低聚糖分解。綜上所述，t=2.5 h，豆渣中功能性低聚糖的提取率最佳。由圖3b可知，V(乙醇提取液)∶m(豆渣)(簡(jiǎn)稱液料比)=10∶1～25∶1 mL/g，隨著提取液的增多，低聚糖的提取率明顯增加，而液料比為25∶1～30∶1 mL/g，低聚糖提取率逐漸平穩(wěn)。綜上所述，豆渣中功能性低聚糖的最佳提取液料比為25∶1 mL/g。由圖3c可知，t=30～60 ℃，隨著提取溫度的不斷升高，低聚糖的提取率明顯增加，這是因?yàn)闇囟壬?，低聚糖類物質(zhì)的滲透能力和擴(kuò)散能力會(huì)隨溫度的升高而增加。隨著溫度的繼續(xù)升高，低聚糖的提取率反而下降，這是因?yàn)闇囟炔粩嗌邥?huì)使低聚糖類物質(zhì)發(fā)生氧化，含量下降。因此確定豆渣功能性低聚糖的最佳提取溫度為60 ℃。由圖3d可知，φ(乙醇)=40%～70%，隨著φ(乙醇)的不斷增加，低聚糖的提取率明顯增加，持續(xù)增加φ(乙醇)，提取率反而下降。可能是低聚糖在乙醇溶液中被其他物質(zhì)溶解，所以導(dǎo)致提取率降低。因此最佳φ(乙醇)=70%，此時(shí)提取率為3.421%。

t/ha 提取時(shí)間

液料比/(mL·g-1)b 液料比

t/℃c 溫度

φ(乙醇)/%d φ(乙醇)圖3 各因素對(duì)豆渣低聚糖提取率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出提取時(shí)間(A)、φ(乙醇)(B)、提取溫度(C)3個(gè)對(duì)提取率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與低聚糖提取率

續(xù)表

表3 豆渣低聚糖提取模型方差分析

由表3可知，以低聚糖的提取率作為響應(yīng)值，該模型P<0.000 1，表明該模型顯著，可以用來(lái)模擬該提取過(guò)程。失擬項(xiàng)P=0.507 7>0.010，失擬項(xiàng)不顯著，表明該回歸模型的誤差較小，可以較好預(yù)測(cè)并且分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由均方和對(duì)比可得3個(gè)因素對(duì)低聚糖提取率的影響程度為提取時(shí)間>提取溫度>φ(乙醇)。利用響應(yīng)面軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程模型。

2.4.2 各因素間交互作用分析

各因素間交互作用分析結(jié)果見圖4。

a 提取時(shí)間和φ(乙醇)交互作用

b 提取時(shí)間和提取溫度交互作用

c φ(乙醇)和提取溫度交互作用圖4 各因素交互作用對(duì)低聚糖提取率的影響

3D立面圖中，越陡峭的一方對(duì)提取率的影響越大。由圖4a可知，提取時(shí)間對(duì)低聚糖提取率的影響程度大于φ(乙醇)；由圖4b可知，提取時(shí)間對(duì)低聚糖提取率的影響程度大于提取溫度；由圖4c可知，提取溫度對(duì)低聚糖提取率的影響程度大于φ(乙醇)。

經(jīng)Design Expert軟件分析可以預(yù)測(cè)最佳條件為提取時(shí)間2.88 h，φ(乙醇)=72.29%，提取溫度60.91 ℃，提取率為3.562%。為了方便繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取條件圓整為提取時(shí)間2.8 h，φ(乙醇)為72%，提取溫度為61 ℃。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)條件及結(jié)果是否準(zhǔn)確，進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。低聚糖平均提取率為3.570%，與預(yù)測(cè)值3.562%相近，表示該模型可靠。

3 結(jié) 論

以豆渣為研究對(duì)象，對(duì)豆渣中功能性低聚糖進(jìn)行提取研究，結(jié)論如下。

(1)單因素實(shí)驗(yàn)表明在提取時(shí)間為2.5 h，液料比為25∶1 mL/g，提取溫度為60 ℃，φ(乙醇)=70%時(shí)，功能性低聚糖提取率為3.421%；

(2)通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得出在提取時(shí)間為2.8 h，提取溫度為61 ℃，φ(乙醇)=72%的條件下，低聚糖的平均提取率為3.570%。