張曉燦 段寶忠 陶愛恩 郭文娟 蒙國懿 楊紹坤

1.云南醫(yī)藥健康職業(yè)學院，云南 昆明 650033；2.云南省高校滇西道地藥材資源開發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000

2型糖尿病是一種多基因遺傳性疾病，胰島素抵抗、脂質代謝紊亂、肥胖、高血壓等因素均參與了該病的發(fā)生，其中胰島素抵抗(insulin resistance，IR)造成的胰島素相對不足是引發(fā)2型糖尿病的關鍵因素[1]。雖然目前降糖西藥能有效的控制高血糖，但對慢性并發(fā)癥的預防和治療仍缺乏有效措施，存在不良反應嚴重、患者依從性差等缺陷[2]。針對糖尿病及其并發(fā)癥，選擇中藥降血糖是一個良好的選擇。中藥降糖呈現多途徑、多渠道、多靶點的特點，具有較大的優(yōu)越性；加之其降血糖作用溫和持久，毒副作用小，可有效地延緩并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[3-7]。因此從中藥中尋找降血糖藥物已經成為一種趨勢。

“藥食同源”品種滇黃精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl為百合科黃精屬多年生草本植物，以根莖入藥[8]。滇黃精以“黃精”之名收載于《中國藥典》，為云南重要的道地藥材，在云南民間具有悠久的藥用歷史，明代《滇南本草》(1483年)中就記載其用于糖尿病的防治[9]。已有文獻研究[10-12]報道滇黃精中的多糖成分是發(fā)揮降血糖作用的主要活性成分之一。為全面評價滇黃精多糖的降血糖作用及作用機制，本實驗采用高脂高糖飼料聯合鏈脲佐菌素(STZ)誘導實驗性糖尿病小鼠評價滇黃精多糖的降血糖作用，并從糖消化吸收、肝臟糖原合成及異生、肌肉組織對糖的利用、胰島組織形態(tài)與功能保護、降血脂、對腎臟的保護等方面，探討滇黃精多糖的降血糖作用。

1 實驗動物、儀器與材料

1.1 材料 滇黃精藥材采集于云南大理，經大理大學段寶忠教授鑒定為滇黃精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl。

1.2 試劑 實驗所用試劑見表1。

表1 實驗所用試劑

1.3 儀器 實驗所用儀器見表2。

表2 實驗所用儀器

1.4 動物 健康清潔級雄性ICR小鼠(18 ～ 22 g)由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號：SCXK(湘)2016-0002。

2 實驗方法

2.1 滇黃精總多糖的制備、分離純化

2.1.1 滇黃精總多糖(PPS)的制備 精確稱取干燥的滇黃精藥材粗粉適量，按m(藥材)：m(95%乙醇)=1∶2進行回流脫脂2 h，過濾得渣，揮干溶劑，備用。將脫脂后的滇黃精粉末按液料比10∶1加入適量水，提取3次，每次提40 min。收集濾液，60 ℃減壓濃縮，加入95%的乙醇，攪拌均勻，以乙醇終濃度70%在室溫下進行醇沉，24 h后收集沉淀，冷凍干燥得滇黃精總多糖(PPS)。

2.1.2 滇黃精總多糖(PPS)的分離純化 未冷凍干燥的70%沉淀滇黃精總多糖PPS，直接加入95%的乙醇，使乙醇終濃度為80%，再次沉淀得到PPS1。PPS1用超純水復溶，上DEAE-瓊脂糖凝膠FF柱(4 cm×50 cm)純化，超純水洗脫4倍柱體積，洗脫流速為2 mL/min，收集洗脫液濃縮。葡聚糖凝膠G-100凝膠層析柱(4 cm×80 cm)進一步純化，超純水洗脫4倍柱體積，收集洗脫液濃縮，凍干即得。

2.2 實驗性糖尿病小鼠模型的建立 ICR小鼠購入后先適應性飼養(yǎng)1周。一部分(15只)用基礎飼料飼養(yǎng)，另一部分用高脂高糖飼料飼養(yǎng)4周。禁食不禁水12 h，小鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素 120 mg/kg，5 d后測血糖，血糖值>11.1 mmol/L的小鼠選取為糖尿病小鼠，用于后期實驗，后期實驗中糖尿病小鼠繼續(xù)用高糖高脂飼料飼養(yǎng)。

2.3 動物分組及給藥 取正常未造模小鼠作為正常對照組，將糖尿病小鼠按血糖值隨機分成四組：糖尿病小鼠模型組、滇黃精總多糖組(PPS)、滇黃精均一多糖組(PPS1)、二甲雙胍陽性對照組，每組15只小鼠。正常對照組及模型組灌胃給予0.9% NaCl，滇黃精總多糖組(PPS)，滇黃精均一多糖組(PPS1)分別灌胃給予1.19 g/kg，陽性組灌胃給予二甲雙胍150 mg/kg，1次/d，連續(xù)15 d。

2.4 實驗評價指標

2.4.1 空腹血糖(FBG)測定 在給藥0 d、5 d、10 d、15 d將各給藥組小鼠禁食過夜(不禁水)，于次日上午9∶00，用羅氏活力型血糖儀測定血糖值(剪尾取血)。

2.4.2 口服葡萄糖耐量(OTGG)測定 給藥 10 d，禁食2 h后，模型組灌胃給予0.9% NaCl，滇黃精總多糖組，滇黃精均一多糖組分別灌胃給予滇黃精多糖1.19 g/kg，陽性組灌胃給予二甲雙胍150 mg/kg，給受試藥的同時，以4.0 g/kg葡萄糖溶液灌胃，分別在給予藥物及葡萄糖后0、30、60、90、120 min時剪尾取血，測血糖值。

2.4.3 血脂水平的檢測 采用全自動生化分析儀測定動物血脂水平，主要包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，并計算TC/HDL值。該實驗委托大理州醫(yī)院醫(yī)學檢驗科完成。

2.4.4 肝、肌糖原含量測定 取動物肝臟、肌肉適量，按試劑盒說明書步驟進行。

2.5 糖尿病小鼠腎臟、胰腺的病理學研究 實驗結束后取小鼠腎臟、胰腺，用福爾馬林(10%中性)固定12 h后，送至大理州醫(yī)院病理科制片(HE染色)。

3 實驗結果與分析

3.1 滇黃精總多糖的分離純化 采用高效凝膠滲透色譜法對PPS1進行分析，結果如圖1所示。PPS1的色譜峰為單一對稱峰，可得出PPS1是一種均一組分，即一種均一多糖。

3.2 滇黃精多糖對實驗性糖尿病小鼠FBG的影響 與正常對照組比較，糖尿病模型組、滇黃精均一多糖組、滇黃精總多糖組、二甲雙胍組小鼠的空腹血糖值FBG均顯著升高(P<0.001)。連續(xù)給藥5、10、15 d后，與糖尿病模型組比較，滇黃精總多糖組動物FBG顯著下降(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，下降幅度分別為下降19.6%，35.6%和36.7%；滇黃精均一多糖組動物FBG亦顯著下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，下降幅度分別為下降37.7%、25.4%和44.4%；二甲雙胍組動物FBG也顯著下降(P<0.05，P<0.001，P<0.01)，下降幅度分別為下降19.1%、50.7%和40.0%。FBG值見表3。

表3 滇黃精多糖對實驗性糖尿病小鼠FBG的影響 (n=15)

綜上所述，給藥5 d后二甲雙胍和滇黃精總多糖、滇黃精均一多糖皆可顯著性降低小鼠FBG，且三者之間差異無統(tǒng)計學意義。給藥15 d后，滇黃精總多糖、滇黃精均一多糖可使糖尿病小鼠FBG顯著降低。

3.3 滇黃精多糖對實驗性糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影響 與正常組比較，各組糖尿病小鼠口服葡萄糖后血糖明顯上升(P<0.01)，30 min達到峰值，120 min時血糖水平有所恢復，但仍較給葡萄糖負荷前明顯升高。與模型組比較，二甲雙胍(P<0.01)、滇黃精總多糖(P<0.05)和滇黃精均一多糖(P<0.01)都可以顯著改善糖尿病小鼠葡萄糖耐量，降低餐后2 h血糖值。實驗結果如圖2所示。

3.4 滇黃精多糖對實驗性糖尿病小鼠血脂水平的影響 與正常組比較，糖尿病模型組小鼠血清中的TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、TC/HDL(P<0.05)、LDL(P<0.01)水平均顯著性升高，HDL水平顯著性降低(P<0.01)。與模型組比較，滇黃精總多糖組小鼠血清中的TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、TC/HDL(P<0.01)、LDL(P<0.01)水平均顯著性降低，HDL水平顯著性升高(P<0.05)；滇黃精均一多糖組小鼠血清中的TC(P<0.01)、TG(P<0.05)、LDL(P<0.01)水平均顯著性降低，TC/HDL、HDL水平無顯著性差異；二甲雙胍組小鼠血清中的TC(P<0.05)、TG(P<0.01)、TC/HDL(P<0.01)、LDL(P<0.05)水平均顯著性降低，HDL水平顯著性升高(P<0.01)。血脂水平測定結果如圖3所示。

3.5 滇黃精多糖對實驗性糖尿病小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響 與正常組比較，糖尿病模型組小鼠的肝糖原、肌糖原含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組、滇黃精總多糖組均可明顯增加肝糖原和肌糖原含量(P<0.01與P<0.05)；滇黃精均一多糖組無顯著性差異。實驗結果如圖4所示。

3.6 滇黃精多糖對實驗性糖尿病小鼠腎臟病理改變的影響 實驗小鼠腎臟HE染色固定結果如圖5所示。糖尿病小鼠腎小球內細胞數目增多，腎小球基底膜增厚。二甲雙胍、滇黃精總多糖組和滇黃精均一多糖組能夠減少這些病理性損傷的發(fā)生。

3.7 滇黃精多糖對實驗性糖尿病小鼠胰腺病理改變的影響 胰腺組織樣本的HE染色切片如圖6所示。正常小鼠的胰腺切片胰島是圓形的，具有均勻排列的胰島細胞，邊界清晰，且胰島比其他組更大、更普遍；糖尿病模型組很少顯示有胰島，且胰腺細胞減少、結構松動和變形、凋亡或壞死細胞增多；滇黃精總多糖組、滇黃精均一多糖組、二甲雙胍組胰腺病變情況與糖尿病模型組比較均明顯改善。與滇黃精總多糖組和二甲雙胍組比較，滇黃精均一多糖組的胰島數量增多、結構完整性較強，胰島細胞分布更加均勻。結果表明，在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠治療中，滇黃精多糖可以減少胰島破壞。

4 小結

高脂高糖飼料加小劑量鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠模型模擬了人類2型糖尿病的發(fā)病過程，且主要癥狀接近于人類2型糖尿病[13-14]。本實驗選用該動物模型對滇黃精多糖抗糖尿病活性進行驗證，并考察了滇黃精總多糖和滇黃精均一多糖的抗糖尿病活性。實驗結果顯示，滇黃精總多糖和滇黃精均一多糖均可使糖尿病小鼠的空腹血糖值顯著性降低(P<0.01，P<0.01)。給藥第5天，滇黃精總多糖組的FBG下降幅度低于滇黃精均一多糖組；給藥第10天，滇黃精總多糖組的FBG下降幅度高于滇黃精均一多糖；給藥第15天，滇黃精總多糖組的FBG下降幅度又低于滇黃精均一多糖組。滇黃精總多糖組和滇黃精均一多糖組降低FBG的作用效果無顯著性差異。

葡萄糖耐量是臨床上診斷糖尿病的一個重要依據，高血糖患者通常會出現葡萄糖耐量降低的現象，改善葡萄糖耐量也是評價抗糖尿病藥物是否有效的重要指標[15]。本研究發(fā)現，滇黃精總多糖和滇黃精均一多糖均能顯著改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量，降低餐后血糖值，兩者無顯著性差異。

糖尿病患者往往伴隨血脂代謝紊亂。同時，高血脂癥是導致糖尿病心腦血管并發(fā)癥出現的重要因素[16]。滇黃精總多糖能降低血清總膽固醇和甘油三酯，增加高密度脂蛋白相對含量，降低低密度脂蛋白水平。此外，還能增加糖尿病轉歸中的肝糖原和肌糖原含量，減少葡糖糖生產，緩解體內糖代謝紊亂現象。滇黃精均一多糖，對高密度脂蛋白的合成無顯著影響，但能顯著降低血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平，促進血脂穩(wěn)態(tài)的形成。

糖尿病是以高血糖為特征的可導致各種并發(fā)癥，危及患者健康的一種內分泌代謝性疾病。糖尿病腎病一般高發(fā)于糖尿病后期患者，且會發(fā)展為終末期腎臟疾病，是糖尿病致死、致殘的主要影響因素[17]。本實驗結果顯示滇黃精總多糖和滇黃精均一多糖均能緩解糖尿病小鼠腎臟病理性結構變化，減少腎小球糖原沉積和纖維化，具有一定的防治糖尿病腎病的作用。胰島是位于胰腺外分泌部之間的球狀細胞團，糖尿病導致胰島β細胞凋亡增加，進而導致胰腺組織損傷[18]。本實驗結果表明滇黃精總多糖和滇黃精均一多糖可修復糖尿病所引起的胰島損害，滇黃精均一多糖的作用效果更佳，可使胰島數量增多、結構完整性增強，胰島細胞分布更加均勻。

綜上所述，滇黃精總多糖和滇黃精均一多糖可改善2型糖尿病小鼠血糖、葡萄糖耐量、血脂水平，并對糖尿病并發(fā)癥的防治具有一定的作用。