孫華文 王秋爽 周佳偉

武漢大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科 湖北 武漢 430060

克羅恩病（Crohn's disease，CD）免疫主要為由Th1 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，Tim-3 只表達(dá)于Th1 細(xì)胞，Tim-3 有關(guān)通路在克羅恩病的相關(guān)免疫細(xì)胞起主要作用。我們的前期研究表明，極化調(diào)節(jié)蛋白非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）與CD纖維化有關(guān)。aPKC-ι 是其新亞型，近年來，生物免疫靶向治療藥物英夫利西（infliximab，IFX）已在CD治療中取得良好療效，能控制免疫細(xì)胞浸潤和炎性反應(yīng)發(fā)生［1］，本研究使用IFX 治療活動期CD 患者，分析在不同時間外周血及腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表 達(dá)水平，探討Tim-3/aPKC-ι 通路對英夫利西單抗治療克羅恩病病程臨床判斷作用。

1 材料與方法

1.1 病例收集收集2009 年6 月至2019 年7 月武漢大學(xué)人民醫(yī)院的住院CD 患者45 例，臨床診斷資料完整、彼此無血緣關(guān)系，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病協(xié)作組制定的《中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見》，其中男25 例，女20 例，年齡中位數(shù)34 歲；患者的疾病活動指數(shù)（CD activity index，CDAI）為（348.45±18.50）分；平均病史（6.24±2.68）年；CD 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均已確診且在入選時均未接受過免疫抑制劑和生物制劑治療，未合并其他自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等。健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：選擇同期接受結(jié)腸鏡檢查并留取活組織標(biāo)本和外周靜脈血標(biāo)本的16 名健康體檢者為健康對照組，其中男10名，女6 名，年 齡21～50 歲，年 齡 中 位 數(shù)32.5 歲。CD 患者與健康對照者年齡及性別組成差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院臨床試驗注冊和經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。CD 患者均于第0、2、6 周分別接受靜脈滴注IFX（5 mg/kg）誘導(dǎo)緩解治療。分別在第0、5、10、15 周評估患者狀況，抽取外周靜脈血，進(jìn)行內(nèi)鏡檢查和活組織檢查，觀察CDAI、血沉（ESR）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）的變化。

1.2 方法

1.2.1外周血T 細(xì)胞亞群的檢測 采集靜脈血1 mL，EDTA 抗凝。取50 μL 抗凝全血細(xì)胞懸液，分別加入熒光標(biāo)記單克隆抗體即鼠抗人CD4-FITC、CD8-FITC、CD28-PE 各10 μL，陰性對照管中加入鼠IgG-FITC 和IgG-PE 各10 μL，混勻置室溫20 ℃避光孵育25 min，加入溶血素0.5 mL，放置15 min，洗滌、離心后檢測。標(biāo)本置流式細(xì)胞儀內(nèi)，做雙色熒光流式細(xì)胞檢測。以不同雙熒光素標(biāo)記組合分析CD4+，CD8+，CD8+CD28+，CD8+CD28-，CD28+的T 細(xì)胞亞群，每次每樣本淋巴細(xì)胞計數(shù)均大于5 000 個。熒光標(biāo)記單克隆抗體購自Sigma 公司，流式細(xì)胞儀型號為美國Coulter 公司產(chǎn)品。

1.2.2靶向RNA 干擾Tim-3 慢病毒載體的構(gòu)建及包裝 應(yīng)用RNAQiDesigner 網(wǎng)站針對Tim-3 基因序列設(shè)計并構(gòu)建4 個慢病毒小發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin RNA，shRNA 序列和1 個對照序列，根據(jù)干擾RNA 序列，完成了對病毒載體（pMAGic4.1）框架構(gòu)建，由上海華生公司代為合成了有關(guān)干擾oligo 片段，并包裝轉(zhuǎn)染慢病毒載體。

1.2.3慢病毒載體轉(zhuǎn)染T 細(xì)胞 將包裝好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞（均由Sigma 公司提供），操作根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行，實驗共分為3 組：T 細(xì)胞組、空載體轉(zhuǎn)染（V-T 細(xì)胞）組以及Tim-3 轉(zhuǎn)染組（Tim-3-T）。

1.2.4引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 中人aPKC-ι（gi：89142743）和GAPDH（gi：33871196）的mRNA 序 列，利 用Primer Express 2.0 軟 件 設(shè) 計 基因?qū)Ｒ恍缘囊?。aPKC-ι 的上游引物5'-GGCTGTTACGATGGTTTATGATGT -3'，下 游 引 物5'-AATCAAAGGCATCATTTTAGGGATA-3'，擴(kuò) 增 子 82 bp；P5：5' - AAAGATCTATGTTTTCAGGTCTTACCCTCAAC - 3'， P6：5' - CGGGATCCTCAGGATGGCTGCTGGCTGTTGAC-3'，該對引物擴(kuò)增Tim-3 全長編碼區(qū)，擴(kuò)增目的片段大小為846 bp；GAPDH 的上游引物5'-CCATCAATGACCCCTTCATTG-3'，下 游 引物5'-CATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3'，擴(kuò)增子66 bp。引物設(shè)計完成后，分別檢測所得總RNA 的質(zhì)量和濃度。然后進(jìn)行cDNA 的合成和熒光定量PCR 檢測反應(yīng)完成后設(shè)定基線值（baseline）和閾值（threshold），讀取閾循環(huán)（Ct）值。根據(jù)公式△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）和△△Ct=△Ct（處理組）-△Ct（對照組），計算2-△△Ct，即為處理組aPKC-ι 表達(dá)量相對于正常組的倍數(shù)。

1.2.5體外試驗 檢測T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果對aPKC-ι的影響，確認(rèn)Tim-3/aPKC-ι 通路的存在：取上述的外周血的上清液，按組進(jìn)行試驗，具體如下：ELISA分析各組上清白細(xì)胞介素（IL）-12、干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-β；使用熒光定量PCR 方法分析各組上清Tim-3 和aPKC-ι mRNA 基因表達(dá)水平變化。

1.2.6治療和檢測

1.2.6.1CD 患者均于第0、2、6 周分別接受靜脈滴注IFX（5 mg/kg）誘導(dǎo)緩解治療。分別在第0、5、10、15 周評估患者狀況，抽取外周靜脈血，進(jìn)行內(nèi)鏡檢查和活組織檢查，觀察CDAI、ESR、CRP 的變化。具體方法：采集空腹靜脈血5 mL，室溫下放置20 min，然后離心10 min，取上層血清樣本分裝于EP管，每管100 mL。存放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用?檢 測Tim-3 和aPKC-ι mRNA 的 表 達(dá)。

1.2.6.2腸黏膜組織內(nèi)后Tim-3 和aPKC-ι mRNA表達(dá)水平 根據(jù)文獻(xiàn)［1］的方法，從腸黏膜組織中提取總RNA 后，用于檢測Tim-3 和aPKC-ι mRNA的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析CD 患者IFX 治療前與健康對照組的比較符合正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗，IFX 治療前后的比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶向RNA 干擾Tim-3 的結(jié)果T 組半定量分析比值為4.62±0.12，而Tim-3-T 細(xì)胞則為1.74±0.04，2 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而T 細(xì)胞、V-T 細(xì)胞無統(tǒng)計學(xué)差異，V-T 細(xì)胞（1.45±0.14）與Tim-3-T 細(xì)胞有顯著性差異（P＜0.05），表明靶向RNA 干擾Tim-3 慢病毒重組載體構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 光鏡下CD4+ Th 細(xì)胞（×400）

2.2 Tim-3 低表達(dá)T 細(xì)胞對細(xì)胞因子分泌的影響ELISA 結(jié)果顯示：經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)以后，T 細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ 因子表達(dá)水平明顯低于T 細(xì)胞、V-T 細(xì)胞組（P＜0.05），提示Th1 類細(xì)胞因子分泌降低（表1、2，圖2、3）。

圖2 aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平

表1 體外shRNA（Tim-3）干擾T 細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)(pg/mL，±s)

表1 體外shRNA（Tim-3）干擾T 細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)(pg/mL，±s)

與T 細(xì)胞組和V-T 細(xì)胞組比較，*P＜0.05

TNF-β 378.09±19.87 370.54±17.27 113.21±45.88*組別T 細(xì)胞組V-T 細(xì)胞組Tim-3-T 細(xì)胞IL-12 405.12±12.56 456.25±11.25 105.18±13.53*IFN-γ 320.54±23.78 343.23±13.44 119.16±8.56*

2.3 IFX 治療開始前（0 周）和治療第5、10 和15 周ESR、CRP 和CDAI 的變化治療前，患者的ESR、CRP 和 CDAI 分 別 為（46.81±0.56）mm/h、（48.43±11.51）mg/L、348.42±18.53，治療后第5周變化不明顯，第10 和15 周ESR、CRP 和CDAI 的變化具有顯著性意義，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.568，均P＜0.05）。見表3。

表2 體外shRNA 干擾T 細(xì)胞后Tim-3 和aPKC-ι mRNA基因表達(dá)水平變化(倍，±s)

表2 體外shRNA 干擾T 細(xì)胞后Tim-3 和aPKC-ι mRNA基因表達(dá)水平變化(倍，±s)

與T 細(xì)胞組和V-T 細(xì)胞組比較，*P＜0.05

aPKC-ι mRNA 4.20±0.67 3.76±0.49 1.21±0.89*組別T 細(xì)胞組V-T 細(xì)胞組Tim-3-T 細(xì)胞Tim-3 3.61±0.75 4.17±0.48 1.14±0.16*

圖3 治療前Tim-3 mRNA 表達(dá)水平（RT-PCR 法）

表3 IFX 治療前后ESR、CRP 和CDAI 的變化(±s)

表3 IFX 治療前后ESR、CRP 和CDAI 的變化(±s)

與第0 和第5 周比較，*P＜0.05

15 周8.32±1.17*11.32±1.88*56.82±1.15*指標(biāo)ESR（mm/h）CRP（mg/L）CDAI 0 周46.82±0.56 48.41±11.50 348.45±18.50 5 周42.82±8.52 41.64±4.61 299.12±14.90 10 周15.32±1.74*17.32±1.54*121.56±1.15*

2.4 IFX 治療前后CD 患者外周血和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 基因表達(dá)水平治療前，CD 患者外周血和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表 達(dá) 水 平（分 別 為5.25±0.89 和5.11±0.45）均明顯高于健康對照者（分別為2.25±0.41 和1.44±0.18），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。治療后第5 周時，CD 患者外周血和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平下降不明顯，相對應(yīng)的臨床ESR、CRP 和CDAI 的變化也不顯著；但是，治療后第10 和15 周時，CD 患者外周血和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平均明顯低于治療前（均P＜0.05）。見表4。

表4 外周血和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平變化(倍，±s)

表4 外周血和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平變化(倍，±s)

與第0 和第5 周比較，*P＜0.05

指標(biāo) 腸黏膜1.49±0.54*1.82±0.18*Tim-3 aPKC-ι 0 周外周血5.25±0.89 5.11±0.45腸黏膜5.77±0.56 5.07±0.35 5 周外周血4.32±1.34 4.69±1.08腸黏膜4.72±0.74 4.26±0.63 10 周外周血2.72±1.78*2.92±1.19*腸黏膜2.69±0.14*2.17±1.36*15 周外周血1.32±0.81*1.67±0.79*

3 討論

Th1 細(xì)胞的過度活化是克羅恩病主要的致病機(jī)制。Monney 等［2］、Dardalhon 等［3］和Meyers 等［4］發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白：Tim-3，一種具有多態(tài)性的細(xì)胞表面膜蛋白，屬于T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白家族成員，其只表達(dá)于Th1 細(xì)胞，是一種負(fù)性免疫調(diào)控因子，通過產(chǎn)生抑制信號導(dǎo)致Th1 細(xì)胞和Tc1 細(xì)胞的凋亡，因而，Tim-3 可抑制Th1 細(xì)胞的功能，影響Th1 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，起到免疫抑制的作用，與慢性感染、自身免疫性疾病、哮喘及腫瘤等疾病有關(guān)［5，6］，Tim-3 由281 個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，編碼Tim 蛋白的基因定位于人染色體5q33.2，鼠染色體11B1.1，這些部位都是與克羅恩病等自體免疫疾病高度相關(guān)的部位［7，8］。

Tim-3 其只表達(dá)于Th1 細(xì)胞，目前還不明確Tim-3 有關(guān)通路在克羅恩病如何起作用。研究發(fā)現(xiàn)：單純Tim-3 的單克隆抗體治療克羅恩病的臨床療效并不理想，其原因在于Tim-3 的有關(guān)通路下游基因的作用機(jī)制不明［9，10］。極化調(diào)節(jié)蛋白aPKC 是細(xì)胞極化調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，aPKC-ι 是其新亞型，是調(diào)控上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和極化重建的關(guān)鍵分子，也有研究［11，12］發(fā)現(xiàn)：aPKC-ι 也可以導(dǎo)致纖維化細(xì)胞在相應(yīng)致纖維化的細(xì)胞介質(zhì)作用下激活，從而發(fā)生致纖維化作用，研究表明aPKC-ι 與腸道的病變密切相關(guān)，可以動態(tài)反映克羅恩病的治療效果，因而可能成為一種反映克羅恩病的治療效果新型標(biāo)志物，極可能是Tim-3 的下游基因，克羅恩病的發(fā)病機(jī)制中存在Tim-3/aPKC-ι 通路。

aPKC-ι 在炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展過程中起促炎作用［13］，能誘導(dǎo)外周血T 細(xì)胞活化，分泌高水平的促炎細(xì)胞因子。aPKC-ι 還可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3 表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)陽性T 細(xì)胞向腸黏膜組織內(nèi)聚集，引起炎性反應(yīng)。aPKC-ι 在炎癥性腸病患者的T 細(xì)胞中高表達(dá)，增強(qiáng)T 細(xì)胞活性及殺傷活性，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞分化，進(jìn)一步引起炎性反應(yīng)。傳統(tǒng)的逐級遞增CD 治療方案雖能避免糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑所致?lián)p害，但不能有效降低CD 相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率［14］。

本文先利用RNA 干擾技術(shù)體外確認(rèn)CD 患者發(fā)病機(jī)制存在Tim-3/aPKC-ι 通路，我們的檢測顯示：Tim-3 shRNA-T 細(xì) 胞 組IL-12 和IFN-γ 以 及TNF-β 的 分 泌 均 明 顯 低 于 對 照 組（P＜0.05）。RNA 干擾Tim-3 基因在T 細(xì)胞表達(dá)后，可抑制下游的aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平以及T 細(xì)胞增殖的作用，提示CD 患者體內(nèi)存在Tim-3/aPKC-ι 通路；本文明確Tim-3/aPKC-ι 通路與英夫利西（IFX）治療的療效存在關(guān)聯(lián)，IFX 治療前，CD 患者在外周血Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表 達(dá) 水 平（5.25±0.89，5.11±0.45）和 腸 黏 膜 組 織 內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平（5.77±0.56，5.07±0.35）均明顯高于健康對照者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。第5 周開始，在第10 周和15 周時，CD 患者外周血Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平均明顯低于治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療前CD 患者的ESR、CRP 和CDA1 和治療后相比無 顯 著 性 差 別，說 明IFX 激 活Tim-3/aPKC-ι 通 路的作用的劑量-效應(yīng)沒有達(dá)到一定時間和強(qiáng)度，在第10 周 和 第15 周ESR、CRP 和CDAI 的 變 化 逐 步 下降，第10 周和第15 周ESR、CRP 和CDAI 的變化差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

IFX 是通過基因工程合成的鼠人雜合抗TNF單克隆抗體，可以經(jīng)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和T 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，溶解產(chǎn)生TNF 的細(xì)胞［15］。目前IFX 已被應(yīng)用于中重度糖皮質(zhì)激素依賴且傳統(tǒng)藥物治療無效的活動期CD 患者。我們發(fā)現(xiàn)，IFX 治療5 周以后，腸黏膜上皮以及固有層中性粒細(xì)胞浸潤減少，單核細(xì)胞下降，CD4+、CD8+、和巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)腸上皮人類白細(xì)胞抗原DR 等位基因異常和固有層細(xì)胞間黏附分子-1 表達(dá)水平明顯下降，表達(dá)TNF 的細(xì)胞數(shù)量減少［16，17］。本研究發(fā)現(xiàn)：CD 患者經(jīng)3 次IFX 誘導(dǎo)治療后，疾病活動指標(biāo)均顯著改善，外周血CD4 T細(xì)胞Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平和腸黏膜組織內(nèi)Tim-3 和aPKC-ι mRNA 表達(dá)水平均顯著下降。提示IFX 治療可能通過Tim-3/aPKC-ι 通路而抑制腸黏膜炎性反應(yīng)，控制CD 患者疾病進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示：RNA 干擾技術(shù)體外確認(rèn)CD患者發(fā)病機(jī)制存在Tim-3/aPKC-ι 通路；IFX 在中和TNF 的 同 時，腸 黏 膜Tim-3 和aPKC-ι 的 表 達(dá) 水 平也 下降。Tim-3/aPKC-ι 通路在IFX 治療CD 中，對IFX 的療效和病程判斷具有重要的臨床意義。