楊永麗 劉海珍 鐘 準(zhǔn)

江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2心血管內(nèi)科，3耳鼻喉科湖北 武漢 430033

膿毒癥（sepsis）是指因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，心臟是膿毒癥損害的主要靶器官之一，膿毒癥心功能障礙（sepsis myocardial dysfunction，SMD）病 死 率 高 達(dá)50%～70%［1］。目前對(duì)膿毒癥導(dǎo)致心功能障礙的機(jī)制尚無(wú)確 切 定 論［2，3］。miRNAs（microRNAs）是 一 類 非 編碼單鏈RNA 分子，在心血管生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［4-10］。在糖尿病心肌病中，miR-499 可導(dǎo)致β-肌球蛋白重鏈（MHC）表達(dá)的上調(diào)，引起心肌肥大、心功能障礙［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-499在膿毒癥心肌組織內(nèi)表達(dá)量降低［8］，但其確切作用機(jī)制尚未明確，因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將重點(diǎn)研究miR-499 與α-MHC、β-MHC 在膿毒癥心功能障礙大鼠模型的血漿、心肌中的表達(dá)量的變化及其參與發(fā)病的可能機(jī)制，希望能為臨床治療膿毒癥提供有價(jià)值的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley 大鼠45 只，體質(zhì)量200～250 g，均購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：WQ20210365。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)（sham 組）、膿毒血癥心功能障礙組［脂多糖（LPS）組］和miR-499 模擬物組（LPS+anomir 組），每組15 只，并飼養(yǎng)于可以隨意獲取食物和水的恒溫［（23±2）℃］動(dòng)物房。本研究經(jīng)江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 模型制備及分組處理使用腹腔注射LPS（10 mg/kg）誘發(fā)膿毒癥心功能不全［11］，sham 組腹腔注射同體積磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。miR-499 和agomir 由吉瑪公司合成（中國(guó)上海）。miR-499 模擬物組（甲氧化修飾的miR-499 激動(dòng)劑，吉瑪）在大鼠造模前連續(xù)3 d 通過(guò)尾靜脈給予注射，agomir 劑量為30 mg/kg。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法大鼠腹腔注射LPS 6 h 后，10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100 g）后，開(kāi)胸取左心房血200 μL、心肌組織100 mg 用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Q-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）。

1.3.1Q-PCR 法檢測(cè)血漿和心肌組織中的miR-499 注射LPS 6 h 后使用核酸純化試劑盒（AXYGEN）提取血漿及心肌組織中的總RNA，使用Nano-Drop2000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Thermo Scientific）評(píng)估濃度和質(zhì)量。按試劑盒說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明，使用試劑盒（Thermo Scientific）對(duì)每個(gè)樣品的總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生20 μL cDNA，用ddH2O 稀釋4 倍后加引物并用GoTap?qPCR Master Mix（Promega）進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)量每個(gè)樣品的熔解曲線以確保產(chǎn)物的特異性，用U6 作內(nèi)參。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃15 s，60 ℃60 s，40 個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-499 正向引物序列5'-GCGCGTTAAGACTTGCAGTG-3'，miR-499 反 向 引 物 序 列5'-GCGCGTTAAGACTTGCAGTG-3'。α-MHC 引物序列為：5'-AGTATGTCACCAAGGGGCAG-3'，β-MHC 引 物 序 列：5'-TGGCACCGTGGACTACAATA-3'。特異性引物由Invitrogen 公司設(shè)計(jì)，用2-ΔΔCT方法計(jì)算miR-499 的表達(dá)量。

1.3.2超聲心動(dòng)圖 注射LPS 5 h 后通過(guò)超聲心動(dòng)儀檢測(cè)心功能（Vivid，Visualsonics，Canada）。全麻成功后剃胸部皮毛，超聲探頭置于胸前，測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricle ejection fractions，LVEF）、短軸縮短率（left ventricle fractional shortening，LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮期內(nèi)徑（LVDs）、左室舒張期末容積（LVVd）、左室收縮期末容積（LVVs）、心率（heart rate，HR）、每分鐘搏出量（stroke volume，SV）、心輸出量（cardiac output，CO），保留圖像用于脫機(jī)分析。

1.3.3Western Blot 心肌組織取出后迅速放入液氮中保存。取出心肌組織并放置在冰塊上，根據(jù)心肌組織重量加入合適比例的RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑（RIPA 與蛋白酶抑制劑比例為1∶100，博士德）后在組織研究?jī)x上進(jìn)行研磨（武漢塞維爾，中國(guó)）。研磨完畢，樣品置于4 ℃離心機(jī)，1 000g，離心15 min 后收集上清。然后用BCA（Solarbio，中國(guó)）法測(cè)定蛋白濃度。將樣品（30 μg）與loading buffer（Solarbio，中國(guó)）混合后99 ℃加熱5 min。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（晶彩，中國(guó)），按順序上樣、電泳，最后在4 ℃、30 V 的條件下將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上（Millipoer，德國(guó)）。5%胎牛血清常溫封 閉2 h，α-MHC（abcam，ab31762，1∶1 000）、β-MHC（1∶1 000，proteintech）、GAPDH（1∶20 000，proteintech）的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。使用辣根過(guò)氧化物偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗（1∶5 000，proteintech）或山羊抗兔（1∶5 000，proteintech）二抗檢測(cè)蛋白質(zhì)，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒（electrochemiluminescence，ECL）（BeyoECL Plus，p0018S），用超靈敏全自動(dòng)成像分析系統(tǒng)（FluorChem E，USA）曝光。最后用ImageJ 進(jìn)行灰度分析。

1.3.4N-端腦利鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptied，NT-proBNP)的測(cè)定 處死大鼠前抽取尾靜脈血放于干燥抗凝管內(nèi)，然后常溫3 000 r/min 離 心15 min，用 德 國(guó)Roche 公 司 產(chǎn) 的Cobase601 電化學(xué)發(fā)光儀及其專用試劑盒對(duì)血漿NT-proBNP 的濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.2 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用one-way ANOVA 進(jìn)行組間比較分析，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)對(duì)多個(gè)獨(dú)立樣本進(jìn)行差異性比較，使用Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行非配對(duì)樣本比較，P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 注射LPS 后大鼠心功能減退，血漿中miR-499、α-MHC 下降，β-MHC 上調(diào)腹腔注射LPS 5 h 后，與sham 組相比，模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的精神萎靡，心率顯著下降，LVEF、LVFS、SV、CO、HR等也分別下降了49.1%、59.2%、39.4%、48.8%、15.9%，與sham 組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LPS+agomir 組與LPS 組相比，心功能明顯改善，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)表1，圖1）。為了進(jìn)一步客觀評(píng)估心衰，通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，我們檢測(cè)了血漿中NTproBNP 的變化，結(jié)果顯示：與sham 組相比，膿毒癥組大鼠血漿中NT-proBNP 顯著升高（P＜0.001）（圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明：膿毒癥引起的大鼠心功能障礙模型建立成功。

圖2 各組大鼠血漿NT-proBNP 指標(biāo)變化

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)變化(±s)

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)變化(±s)

與Sham 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與LPS 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；n=15

LPS+agomir 組66.15±2.01##36.16±1.43##15.86±1.06##50.98±2.32#39.73±0.68##38.24±1.53###438.3±6.04##指標(biāo)LVEF(%)LVFS(%)LVVs(μL)LVVd(μL)CO(mL/min)SV(μL)HR(次/min)Sham 組65.94±2.16 35.47±1.48 16.09±2.02 49.43±2.39 44.03±0.70 36.00±1.36 424.0±6.63 LPS 組32.34±2.41**21.20±1.32***26.71±1.39**40.98±2.10*21.94±0.39***14.40±1.34**356.3±5.37**

圖1 各組大鼠心功能指標(biāo)變化

2.2 膿毒癥大鼠血漿和心肌組織中miR-499、α-MHC、β-MHC 的表達(dá)首先，通過(guò)Q-PCR 技術(shù)，我們檢測(cè)了膿毒癥大鼠血漿miR-499 的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：與sham 組相比，模型組大鼠miR-499 水平顯著下降（**P＜0.01）（圖3）。通過(guò)Q-PCR 檢測(cè)了血漿中α-MHC、β-MHC mRNA 的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：與sham 組相比，模型組大鼠血漿中α-MHC mRNA 的表達(dá)水平顯著下降，而β-MHC mRNA 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）（圖4）。

圖3 各組大鼠血漿中miR-499 的表達(dá)變化

圖4 各組大鼠血漿中α-MHC、β-MHC mRNA 表達(dá)變化

同樣，我們檢測(cè)了造模后6 h 的心肌組織中miR-499、α-MHC、β-MHC 表達(dá)量，結(jié)果顯示：與sham 組相比，模型組miR-499 表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）（圖5）；α-MHC mRNA 及其蛋白表達(dá)量下降，β-MHC mRNA 及其蛋白量上調(diào)（P＜0.01）（圖6～8）。

圖5 各組大鼠心肌組織miR-499 的水平變化

圖6 各組大鼠心肌組織中α-MHC、β-MHC mRNA表達(dá)變化

2.3 過(guò)表達(dá)miR-499 后大鼠心功能改善，血漿及心肌組織中α-MHC 表達(dá)增加，β-MHC 水平下調(diào)在注射LPS 造模前3 d，通過(guò)大鼠尾靜脈注射miR-499 的agomir，1 次/d，從而過(guò)表達(dá)miR-499。通過(guò)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，結(jié)果顯示：與LPS 組相比，LPS+agomir 組大鼠LVEF%，LVFS%顯著升高，LVVd顯著下降（**P＜0.01，***P＜0.001；表1，圖1）。通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，檢測(cè)血漿中的NT-proBNP，結(jié)果顯示：與LPS 組相比，LPS+agomir 組顯著下降（***P＜0.001；圖2）。通過(guò)Q-PCR 檢測(cè)了血漿及心肌組織中α-MHC、β-MHC mRNA 的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：與LPS 組相比，血漿及心肌組織中α-MHC mRNA 表達(dá)上調(diào)，β-MHC mRNA 表達(dá)下調(diào)（**P＜0.01；圖4、6）；采用Western Blot 檢測(cè)了心肌組織中α-MHC、β-MHC 的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與LPS 組相比，LPS+agomir 組α-MHC 的 下 調(diào) 被 逆 轉(zhuǎn)，β-MHC 顯著下調(diào)（**P＜0.01，圖7、8）。

圖7 各組大鼠心肌組織α-MHC、β-MHC 蛋白表達(dá)分析

圖8 各組大鼠心肌組織α-MHC、β-MHC 蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

膿毒癥指因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，能導(dǎo)致多器官功能衰竭，是重癥加強(qiáng)護(hù)理病房（Intensive Care Unit，ICU）常見(jiàn)的死亡原因之一［12］。膿毒血癥一般為細(xì)菌的內(nèi)毒素引起，也有人證明是不受控制的免疫和炎癥反應(yīng)、心肌和線粒體能量代謝紊亂及細(xì)胞凋亡導(dǎo)致［13］。miRNAs 是一類長(zhǎng)約21～25 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，通過(guò)種子序列與信使RNA 的3'末端非編碼區(qū)（3'-UTR）上的相應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)［14］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在心血管生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［4-10，15-17］。在糖尿病心肌病中，miR-499 可導(dǎo)致β-MHC 表達(dá)的上調(diào)，引起心肌肥大、心功能障礙［6］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，miR-499 在膿毒癥心肌組織內(nèi)表達(dá)量降低［8］，并引導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

肌球蛋白重鏈（myosinheavy chain，MHC）由肌球蛋白重鏈α（α-MHC）和β（β-MHC）亞型構(gòu)成，是心肌細(xì)胞的主要收縮蛋白［18］。其中α-MHC 有很強(qiáng)的ATP 酶活性，能催化ATP 水解為ADP，引起心肌收縮，而β-MHC 的催化能力弱［19］，心臟泵衰竭后α-MHC 不能轉(zhuǎn)化為β-MHC，并出現(xiàn)α-MHC 下調(diào)、β-MHC 上調(diào)，β-MHC/α-MHC 的比值增大，導(dǎo)致的結(jié)果是心肌收縮功能下降，是心力衰竭的重要標(biāo)志［20］。既往的研究表明，在終末期心衰時(shí)，α-MHC的基因表達(dá)量可顯著降低，而以α-MHC 轉(zhuǎn)變?yōu)棣?MHC 為特征的心肌重構(gòu)，可降低心肌縮短速率及舒縮功能，促進(jìn)心力衰竭的病情進(jìn)展［21］。

在本研究中，我們觀察了miR-499 與α-MHC、β-MHC 在膿毒癥心功能障礙大鼠模型的血漿、心肌中的表達(dá)量的變化及其參與發(fā)病的可能機(jī)制。腹腔注射LPS 后大鼠出現(xiàn)了明顯的精神萎靡，左心室整體收縮功能顯著下降，血漿中NT-proBNP 顯著升高，以上結(jié)果說(shuō)明：膿毒癥引起的大鼠心功能障礙模型建立成功。

通過(guò)檢測(cè)大鼠血漿miR-499 的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠miR-499 水平較對(duì)照組顯著下降，說(shuō)明miR-499 可能參與了LPS 誘導(dǎo)的心功能障礙的發(fā)病。檢測(cè)血漿中α-MHC、β-MHC mRNA 的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，模型組大鼠血漿中α-MHC mRNA 的表達(dá)水平顯著下降，而β-MHC mRNA 的表達(dá)水平顯著升高。這些結(jié)果表明：膿毒癥引起的心功能障礙的發(fā)病伴隨著miR-499、α-MHC、β-MHC 等物質(zhì)的失調(diào)，它們可能共同參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展。

過(guò)表達(dá)miR-499 后大鼠心功能改善，血漿及心肌組織中α-MHC 表達(dá)增加，β-MHC 水平下調(diào)，通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-499，逆轉(zhuǎn)了α-MHC 的降低，下調(diào)了β-MHC 的表達(dá)，說(shuō)明靶向miR-499 的水平可以通過(guò)調(diào)節(jié)α-MHC、β-MHC 的表達(dá)改善膿毒癥引起的心功能障礙。因此miR-499/MHC 途徑可能成為治療膿毒癥心功能障礙的潛在靶標(biāo)。

該研究也存在一些局限性，雖然miR-499 與臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的報(bào)道很多，但miR-499 在膿毒癥心功能障礙中的作用機(jī)理尚不明確。本課題在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)miR-499 參與膿毒癥心功能障礙的機(jī)制進(jìn)行了一些研究，但缺乏臨床大樣本數(shù)據(jù)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，因此，在后期，我們也會(huì)在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，miR-499 能通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠心肌組織中α-MHC、β-MHC 的表達(dá)水平，改善膿毒癥引起的心功能障礙，這些提示靶向調(diào)節(jié)miR-499 的表達(dá)可以成為治療SMD 的有效途徑。