楊聰美，胡淋淋，鄭小蔚，吳晶晶

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建泉州 362000

妊娠期糖尿?。℅DM）是圍生期常見的并發(fā)癥，發(fā)病率為2.3%~4.3%[1]，隨著人們生活水平的提高及二胎政策的開放，GDM 的發(fā)病率逐年增加。 研究表明，GDM 不但在近期影響到產(chǎn)婦， 在遠期發(fā)展中可增加妊娠婦女及其子代并發(fā)癥發(fā)生， 且子代糖尿病的發(fā)生率亦明顯升高[2-3]。 腸道菌群作為微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛參與人體的營養(yǎng)、代謝、免疫調(diào)控及機體炎癥反應(yīng)[4-5]。研究顯示，GDM 的發(fā)生、發(fā)展與腸道菌群失調(diào)直接相關(guān)。 基于此， 該研究選2021 年6—11 月收集80 例妊娠期糖尿病患者進行研究，同時與健康孕婦作為對照組，旨在獲得妊娠期糖尿病患者腸道菌群分布特點及與血脂、IL-6 的關(guān)系。 現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

診斷標準[6]：即對所有尚未被診斷為糖尿病的孕婦，在妊娠24~28 周及孕28 周后首次就診時行75 g OGTT，空腹、服糖后1 h 和2 h 血糖界值分別為5.1、10.0、8.5 mmol/L，其中任何一項血糖值達到或超過上述標準即診斷為GDM。 納入標準[7]：選取于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院產(chǎn)科門診產(chǎn)前檢查， 妊娠24~28周的孕婦作為研究對象。依據(jù)2017 年ADA GDM 診斷標準，所有受試者入組前需簽署知情同意書。排除標準[8]：①樣本采集前30 d 內(nèi)服用過抗生素或抗真菌藥物者。②采集樣品前2 周服用過益生菌產(chǎn)品者。③孕前及孕早期即被診斷為糖尿病者。 ④1 個月內(nèi)曾服用過可能干擾糖、脂代謝藥物（如胰島素、格列本脲、消炎痛、酚妥拉明、速尿、苯妥英鈉、可的松等）者。⑤合并影響糖代謝或腸道微生態(tài)疾?。ㄈ缂谞钕俟δ墚惓！⑾?、高血壓、腹瀉、炎癥性腸病、腸應(yīng)激綜合征、 胃腸道手術(shù)史等） 者。 ⑥抽煙飲酒者。 將GDM 孕婦設(shè)置為研究組， 健康孕婦設(shè)置為對照組，各 80 名。 研究組年齡 21.0~35.0 歲， 平均 （27.63±2.51）歲；孕周 24.0~28.0 周，平均（25.04±2.45）周。 對照組年齡 21.0~35.0 歲，平均（28.28±2.37）歲；孕周24.0~28.0 周，平均（25.13±2.51）周。 兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 該研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 大便標本采集 將所有研究對象的糞便（≥2 g）均于排便后30 min 內(nèi)收集在密閉的無菌離心管內(nèi)，將上述標本迅速儲存于-80℃低溫冰箱。

1.2.2 血清標本采集 將所有研究對象的空腹靜脈血（≥2 mL）收集在非抗凝管內(nèi)（普通紅色頭蓋生化管），2 h 內(nèi)室溫下在 3 000 r/min，離心 10 min，取上層血清于凍存管中-80℃冰箱保存。

1.2.3 生化指標收集 收集總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）指標及白介素-6（IL-6）指標。

1.2.4 細菌基因組總DNA 提取 使用Sigma 細菌基因組DNA 試劑盒提取糞便細菌總DNA。

1.2.5 DNA 的純化①每500 微升DNA 加入0.5 gCsCl，混合后在室溫下放置3 h，離心20 min(8 000 r/min)。②收集上清液，加入無菌水和冰異丙醇，混合后放置15 min,離心 15 min，沉淀的 DNA 溶于 500 μl TE 緩沖液。③加入 100 μl 8M KOA 溶液，放置 15 min，離心 15 min，收集上清液，加入0.6 倍體積冰異丙醇，輕輕混合后置于冰上 10 min。 離心 10 min， 沉淀的 DNA 用70 %乙醇沖洗后，溶于500 μl 的TE 緩沖液。

1.2.6 細菌16S rRNA 基因擴增 使用細菌16S通用引物， 擴增糞便樣品的16S rRNA V4 保守區(qū)，PCR擴增每個樣品對應(yīng)相應(yīng)的barcode 上下游引物信息，擴增體系為25 μl 體系，采用Takara Ex Taq，細菌總DNA 模板為 2 μl。 擴增條件如下：94℃，2 min；94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，30 s；25 個循環(huán)；72℃，5 min[9-10]。

1.2.7 細菌16S rDNA 基因測序 使用 Qubit 2.0 和0.8%瓊脂糖凝膠電泳對提取得到的DNA 進行質(zhì)檢。使用MetaVxTM文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建測序文庫。 使用Agilent2100 Bioanalyzer 對文庫進行質(zhì)檢， 帶有不同barcode 的文庫通過定量和均一化， 混合后使用Illumina MiSeq 測序儀進行300PE 測序。

1.3 統(tǒng)計方法

采用qiime 2.0 對腸道菌群組成進行生物信息學(xué)分析，通過Bray-cuits, Weighted Unifac, Unweighted Unifrac 等方法分析菌群整體結(jié)構(gòu)差異； 利用Wilcox 秩和檢驗、隨機森林（Random Forest）、LEfSe等方法，篩選出對分組效果貢獻最高的OTU 或物種列表； 再根據(jù)微生物群落豐度信息計算樣本中物種之間的相關(guān)性，并據(jù)此劃分不同的共變化組（CAG），使用Spearman 分析CAG 與生理指標的相關(guān)性；用隨機森林 （Random Forest） 的方法篩選出最重要的marker， 隨后用10 倍交叉驗證和ROC 選出最優(yōu)的Biomarker 組合和設(shè)計出最優(yōu)的分類器。 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行臨床數(shù)據(jù)分析， 符合正態(tài)分布的計量資料用（）表示，比較采用 t 檢驗；3 組及以上均數(shù)比較采用One-wayANOVA。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸道菌群菌落數(shù)比較

研究組腸球菌、腸桿菌、擬桿菌群菌落數(shù)高于對照組，乳桿菌、雙歧桿菌低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 兩組梭桿菌菌落數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 兩組腸道菌群菌落數(shù)比較[（），logN/g]

表1 兩組腸道菌群菌落數(shù)比較[（），logN/g]

組別研究組（n=80）照組（n=80）對t 值P 值腸球菌8.30±1.46 7.01±0.92 6.686＜0.001腸桿菌 乳桿菌 雙歧桿菌9.77±0.98 7.01±0.63 21.189＜0.001 5.39±0.68 7.73±1.43 13.218＜0.001 7.39±0.66 10.63±0.73 29.447＜0.001梭桿菌 擬桿菌3.47±0.59 3.51±0.72 0.384 0.701 9.47±1.65 7.86±1.42 6.546＜0.001

2.2 兩組血液指標比較

研究組IL-6 與血脂指標中TC、TG及LDL-C 高于對照組，而HDL-C 低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 兩組血液指標比較[（），mmol/L]

表2 兩組血液指標比較[（），mmol/L]

組別研究組（n=80）對照組（n=80）t 值P 值TC 5.94±1.72 4.11±0.62 26.640＜0.001 TG HDL-C 2.30±0.66 1.04±0.08 16.951＜0.001 1.77±0.18 2.85±0.32 26.310＜0.001 LDL-C IL-6（mg/L）4.53±0.43 2.14±0.31 40.326＜0.001 148.37±19.67 77.63±12.52 27.136＜0.001

2.3 腸道菌群與血脂、IL-6 的相關(guān)性

分析結(jié)果顯示，腸球菌與TC、TG、LDL-C 及IL-6 呈正相關(guān) （P＜0.05）； 腸桿菌與 TC、TG、LDL-C 及IL-6 呈正相關(guān)（P＜0.05）；乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌與 TC、TG、LDL-C 及 IL-6 呈負相關(guān)（P＜0.05）。 見表3。

表3 腸道菌群與血脂、IL-6 的相關(guān)性分析

3 討論

妊娠期糖尿病是孕期最常見的并發(fā)癥之一，近年發(fā)病率逐漸升高，嚴重影響母嬰健康。 研究顯示，孕期女性腸道菌群組成和數(shù)量隨孕周的延長逐漸改變患者腸道菌群水平，可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。機體腸道除能吸收人體飲食外， 還能直接吸收小分子的葡萄糖或單糖，研究指出，腸道菌群通過刺激腸道產(chǎn)生某些特定細胞因子，影響胰島素的敏感性[11-13]。 當多種因素引發(fā)益生菌數(shù)量下降，致病菌數(shù)量增加時，腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境破壞導(dǎo)致菌群失調(diào)， 循環(huán)系統(tǒng)中內(nèi)毒素水平上升，產(chǎn)生慢性炎癥及糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病。腸道微生物可以將食物中的碳水化合物降解成單糖，還可以通過發(fā)酵膳食纖維而產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs），其參與膽汁酸的合成、代謝和重吸收，進而對脂類的消化和吸收產(chǎn)生了間接的影響[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)， 腸道菌群中些條件致病菌產(chǎn)生的脂多糖（LPS）進入血液，上調(diào)脂肪組織中促炎性細胞因子和趨化因子的表達，進而參與炎癥反應(yīng)[16]。 在相關(guān)研究中指出，腸球菌和腸桿菌是最常見的腸道致病菌，威脅消化系統(tǒng)正常生理功能； 乳桿菌和雙歧桿菌為腸道益生菌，可抑制腸道內(nèi)致病菌增殖，降低腸道pH，調(diào)節(jié)微生態(tài)環(huán)境； 梭桿菌和擬桿菌與腸道黏膜正常生理結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)， 且結(jié)構(gòu)改變與糖尿病等代謝性疾病明顯相關(guān)。 該研究中，研究組腸球菌、腸桿菌、擬桿菌群菌落數(shù)高于對照組，而乳桿菌、雙歧桿菌低于對照組（P＜0.05）。 考慮到腸道乳酸桿菌不僅能夠幫助腸道對食物進行消化吸收， 且能夠調(diào)節(jié)血脂，分解有毒物質(zhì)。 推測在GDM 患者中由于雙歧桿菌和乳酸桿菌總數(shù)的降低導(dǎo)致炎癥因子表達的升高，導(dǎo)致患者加劇GDM 的發(fā)生或發(fā)展，形成惡性循環(huán)。 GDM 患者腸道乳酸桿菌減少，腸道天然屏障減弱[17]。 分析結(jié)果顯示，腸球菌與 TC、TG、LDL-C 及IL-6 呈正相關(guān)（P＜0.05）；乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌與 TC、TG、LDL-C 及 IL-6 呈負相關(guān)（P＜0.05）。 在糖尿病中，胰島素抵抗是妊娠期糖尿病的病理基礎(chǔ)，炎癥因子水平增加是胰島素抵抗的直接結(jié)果之一。 妊娠期糖尿病患者代謝產(chǎn)物增加， 改變腸道的厭氧環(huán)境和pH 水平，而益生菌多屬于專性厭氧菌，雙歧桿菌和乳酸桿菌總數(shù)對腸道內(nèi)環(huán)境改變的敏感性最強，能夠調(diào)節(jié)炎癥因子，降低胰島素的抵抗，降低血糖。Hamid Akash M S 等[18]研究中指出，選取妊娠期糖尿病者110 例及健康體檢女性為對照組。 妊娠期糖尿病者腸球菌、腸桿菌、擬桿菌的菌落數(shù)明顯高于對照組， 妊娠期糖尿病組 IL-6 水平 （148.84±15.37）mg/L明顯高于正常對照（76.72±11.14）mg/L（P＜0.05）。

綜上所述， 在妊娠期糖尿病患者中腸道菌群腸球菌、腸桿菌、擬桿菌群菌落數(shù)較多，且腸球菌、腸桿菌與血脂、IL-6 水平呈正相關(guān)。