魏林生，郭園園，章亞芳，趙曉陽，陸向東，陳金城，吳仁芽

(1.南昌大學資源與環(huán)境學院，江西 南昌 330031；2.上海烯峰科技有限公司，上海 201712；3.江西銀麗直飲水設備有限公司，江西 新余 338004)

自然界中的有害微生物嚴重威脅人類的生命健康。細菌對人類的危害促使著我們在現(xiàn)有抗菌劑的基礎上開發(fā)出新興的、復合型的高效抗菌劑勢在必行[1-4]。而自從石墨烯(graphene oxide，GO)的抗菌作用被報道以來，石墨烯類材料因其特殊的物理化學結構而得到了廣大學者的關注[5-7]。石墨烯量子點(graphene quantum dots,GQDs)作為石墨烯的衍生物，具有比石墨烯更大的比表面積[8-9]，而這種優(yōu)異的結構特性對細菌有較好的吸附作用，有利于對細菌的捕獲，從而抑制細菌的生長，GQDs與微生物獨特的作用方式使其在抗菌方面的應用具有廣闊的發(fā)展前景[10-11]。

石墨烯的抗菌能力不僅與表面基團以及摻雜質(zhì)存在著直接聯(lián)系[12-13]，還對尺寸具有一定的依賴性[14]，不同的方法制備出的不同尺寸的GQDs的吸收峰[15-17]、熒光顏色[18-21]等都不同，其抗菌能力[22-24]也存在著明顯差異。

傳統(tǒng)的石墨烯量子點的制備過程復雜，難以量產(chǎn)，且只有在紫外光下對光有明顯的吸收，而在可見光下幾乎無響應。本文采用簡單高效且創(chuàng)新方法——震蕩沖擊法來制備石墨烯量子點，并對其光學特性、光熱效應、光動力效應及抑菌性能進行研究，從而進一步推進GQDs在殺菌領域的研究。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

蛋白胨、酵母粉、瓊脂購自上海微生物科技有限公司；大腸桿菌購自上海保藏生物技術中心；無水乙醇、無菌生理鹽水、鹽酸、氫氧化鈉、PBS、2.5%戊二醛等試劑購自沃瑞達斯有限公司。

1.2 GQDs的合成

采用震蕩沖擊法制備石墨烯量子點：將石墨粉和惰性氣體通過加料管進入第一震蕩沖擊機腔體內(nèi)，經(jīng)過腔體和沖擊介子的高效運動，得到石墨烯量子點半成品；后將半成品和惰性氣體經(jīng)加料管加入第二震蕩沖擊機腔體內(nèi)繼續(xù)震蕩沖擊，可獲得合格的球形納米石墨烯量子點。

1.3 激光誘導GQDs的光熱轉換

稱量一定量的GQDs粉末于蒸餾水中超聲，制成質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1的水溶液，取200 μL置于透明的玻璃管中，密封管口，以低功率密度(2 W·cm-2)的808 nm的紅外激光束垂直照射玻璃管中的樣品，實時監(jiān)測并記錄樣品的溫度，以相同體積的蒸餾水作為對照組，每組實驗重復3次。

1.4 菌液和培養(yǎng)基的制備

取1.00 g胰蛋白胨，0.50 g氯化鈉和酵母提取物，溶于100.0 mL去離子水中，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫，得到瓊脂液體培養(yǎng)基。而瓊脂固體培養(yǎng)基需在上述配方中加入3.00 g瓊脂，高壓滅菌后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，待瓊脂凝固，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ∩僭S大腸桿菌菌液于35 mL的瓊脂液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，220 r·min-1的搖床上培養(yǎng)過夜后，取10 mL菌液離心，將菌液的吸光度A調(diào)整至0.5，即可得到菌體濃度CE為5×108cfu·mL-1的大腸桿菌菌液。

1.5 大腸桿菌生長曲線的繪制

于6個新滅菌的培養(yǎng)瓶內(nèi)，各加入60 mL的瓊脂液體培養(yǎng)基、紫外照射20 min處理后的200 μL大腸桿菌溶液和GQDs，調(diào)整GQDs濃度，于37 ℃，220 r·min-1震蕩培養(yǎng)。每隔1 h記錄溶液600 nm下的吸光度A600，直至菌液的吸收值不再明顯增長為止，每組實驗重復3次。

1.6 GQDs的抑菌性能研究

取0.2 mL的大腸桿菌溶液于6個2 mL的玻璃管中，加入GQDs，調(diào)整其濃度。用近紅外激光在管壁正上方5 cm處照射20 min，未加入GQDs的菌液作為實驗對照。再取0.2 mL的大腸桿菌溶液于6個2 mL玻璃管中，加入GQDs，調(diào)整其質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1，用近紅外激光在管壁正上方5 cm處照射一定時間后，將菌液稀釋104倍，取100 μL滴在瓊脂固體培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液均勻地涂布在平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計數(shù)，大腸桿菌的存活率按以下公式計算：

式中：Rs為細菌存活率，%；nexp為實驗組菌落個數(shù)；ncon為對照組菌落個數(shù)。

每組數(shù)據(jù)重復3次后取其平均值，計算誤差。

2 實驗結果與討論

2.1 GQDs的材料表征

對石墨烯量子點材料進行了表征。圖1為石墨烯量子點的紫外-可見光光譜表征圖，可知，在200～230 nm的紫外光階段，吸光度有略微的下降，而后在230～400 nm之間呈上升趨勢，至400 nm后幾乎保持不變?？梢姶耸┝孔狱c不僅在紫外階段對光有明顯的吸收，在可見光階段也表現(xiàn)出良好的光學吸收特性。圖2為GQDs的粒徑分布圖(圖中I代表強度)，由圖可知，此GQDs平均粒徑為4 483 nm，但粒徑分布稍有不均。

2.2 GQDs的光熱升溫曲線

在低功率密度(2 W·cm-2)的808 nm的激光照射下，GQDs水溶液可以產(chǎn)生大量的熱。從圖3(a)中可以看出，GQDs水溶液在光照20 min后，其溫度隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而增大，當GQDs的質(zhì)量濃度從0.2 mg·mL-1升高至2.0 mg·mL-1時，GQDs水溶液在激光照射30 s時，溫度從28.5 ℃升高至30.1，31.8，33.6，34.5，38.3，44.3 ℃，隨著激光照射時間的增加，溫度逐漸升高，在照射6 min后，溫度基本達到最大值，溶液溫度升高了約15～37.7 ℃。GQDs的質(zhì)量濃度從0提高至1.0 mg·mL-1，溫度升高了(23.2±0.5) ℃，而從1.0 mg·mL-1提高至2.0 mg·mL-1時，溫度僅提升了(6.1±0.5) ℃，而對照組蒸餾水在激光照射20 min后，溫度僅上升到32.2 ℃，升溫幅度僅為3.7 ℃左右。實驗結果表明，GQDs具有較好的光熱轉換能力，且熱效應會隨著濃度的增大而進一步增強，但增長趨勢變緩。

λ/nm圖1 GQDs紫外-可見光表征圖Fig.1 UV-visible light characterization of GQDs

d/nm圖2 GQDs粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of GQDs

t/min(a) GQDs升溫曲線

t/min(b) GQDs在30 s時的升溫圖3 GQDs水溶液在808 nm激光照射下的升溫情況Fig.3 Heating of GQDs aqueous solution under 808 nm laser irradiation

2.3 GQDs對大腸桿菌生長的影響

細菌培養(yǎng)液在600 nm處的光密度(A600)反映了培養(yǎng)液中細菌濃度的高低。本實驗將一定量的GQDs和大腸桿菌菌液在激光照射后加入瓊脂液體培養(yǎng)基中，每隔1 h，測量菌液在600 nm處的吸光度A600，繪制出不同GQDs質(zhì)量濃度下大腸桿菌的生長曲線。

如圖4所示，菌液的初始吸光度相同，隨著培養(yǎng)時間的增加，大腸桿菌在培養(yǎng)基中不斷地生長、繁殖，溶液的吸光度不斷增大。當GQDs的質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1時，大腸桿菌的生長曲線略低于對照組，即GQDs對大腸桿菌的抑制效果很不理想，但隨著GQDs質(zhì)量濃度的增加，溶液的吸光度減小，抑菌效果逐漸增強。由圖4可知，當GQDs的質(zhì)量濃度達到1.0 mg·mL-1時，大腸桿菌的生長曲線幾乎與橫軸平行，說明溶液中菌液含量極低，大腸桿菌的生長幾乎被完全抑制。實驗結果表明，GQDs能夠抑制大腸桿菌的生長，且抑制作用隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強，當GQDs的質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時，大腸桿菌的生長幾乎被完全抑制。

t/h圖4 GQDs對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.4 Effect of GQDs on the growth curve of Escherichia coli

2.4 GQDs對大腸桿菌的抑制作用

將大腸桿菌菌液稀釋104倍，涂布于瓊脂固體培養(yǎng)基上，在最適宜的條件下培養(yǎng)24 h，計數(shù)平板內(nèi)的菌落并計算大腸桿菌的存活率。

由圖5可知，在低功率密度(2 W·cm-2)808 nm的激光照射下，大腸桿菌的存活率Rs隨著GQDs質(zhì)量濃度ρ(GODs)的增加而逐漸降低。當GQDs的質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1時，大腸桿菌的存活率就低于10%，說明此質(zhì)量濃度下的GQDs對大腸桿菌的抑制作用較為明顯，絕大多數(shù)的大腸桿菌已經(jīng)死亡。但1.0 mg·mL-1的GQDs在激光照射10 min的情況下，仍有極少數(shù)的大腸桿菌存活，而照射時間增加至20 min，大腸桿菌的生存率達到0。另外，GQDs在光照20 min時大腸桿菌的存活率均低于照射10 min時的大腸桿菌的存活率。上述實驗結果表明，激光照射時間也是影響GQDs抑菌作用的重要因素之一。圖6是GQDs質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1時，不同激光照射時間對抑菌作用的影響。由圖6可知，激光照射5 min后，大腸桿菌的存活率只有18.36%，隨著光照時間的增加，大腸桿菌存活率逐漸降低，光照時間達到10 min時，大腸桿菌的存活率低于10%，而在照射25 min后，大腸桿菌被完全殺滅。

ρ(GQDs)/(mg·mL-1)圖5 GQDs對大腸桿菌存活率的影響Fig.5 Effect of GQDs on Escherichia coli survival rate

t/min圖6 光照時間對大腸桿菌存活率的影響Fig.6 Influence of illumination time on the survival rate of Escherichia coli

由上述實驗可知，光照時間和GQDs質(zhì)量濃度對大腸桿菌的抑制作用均有重要影響。如果提高GQDs質(zhì)量濃度，殺滅細菌的時間將會進一步縮短，由此可見，在激光照射下，GQDs可以短時、高效地殺滅細菌。

2.5 GQDs抑菌機制分析

2.5.1 光熱效應和光動力效應

GQDs能將吸收的光能轉換成熱能，為驗證GQDs光熱效應對抑菌作用的影響，將大腸桿菌在不同的溫度下單獨作用20 min，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)16 h后，測量大腸桿菌在600 nm的吸光度，如圖7所示，吸光度的數(shù)值隨著溫度的升高而降低，當溫度從室溫升高至70 ℃時，吸光度從1.709降低至1.564，即大腸桿菌菌液濃度CE從0.546×106cfu·mL-1降低至0.482×106cfu·mL-1，由此可說明，大腸桿菌活性在此溫度范圍內(nèi)受光熱效應的影響。但僅在光熱效應的作用下，大腸桿菌的濃度降低較小，難以達到安全殺菌的目的。但GQDs在激光的照射下，光熱效應總伴隨光動力效應同時產(chǎn)生，由圖5和圖6可知，GQDs在光熱效應和光動力效應的共同作用下可以達到安全殺菌的效果。

θ/℃圖7 溫度對大腸桿菌活性的影響Fig.7 Effect of temperature on Escherichia coli activity

而在有光激發(fā)的情況下，碳點中的光能引發(fā)電荷轉移，在光動力效應下會產(chǎn)生活性氧物種(reactive oxygen species,ROS)，從而對細菌結構造成破壞或?qū)е录毦劳觥D8為GQDs對大腸桿菌活性的影響，可知，大腸桿菌菌液濃度隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而減小，當GQDs質(zhì)量濃度達到0.8 mg·mL-1，大腸桿菌菌液濃度為0。由此可說明，GQDs在光動力效應下可以殺滅細菌。

ρ(GODs)/(mg·mL-1)圖8 GQDs對大腸桿菌活性的影響Fig.8 Effect of GQDs on Escherichia coli activity

為了驗證GQDs抑菌過程中的氧化還原機制，采用活性氧熒光標記物二氯熒光黃二乙酸酯(DCFH-DA)對實驗中產(chǎn)生的自由基和活性氧進行標記。無熒光的DCFH遇到細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧如·OH時，將被氧化成DCF而發(fā)出綠色的熒光。由圖9可知，經(jīng)過GQDs處理過的菌液發(fā)出了綠色的熒光，而沒有經(jīng)過GQDs處理過的菌液表現(xiàn)出來的熒光較為微弱。實驗結果表明，GQDs在抑菌過程中產(chǎn)生了ROS，可與細菌胞內(nèi)物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生氧化作用，破壞細菌的細胞結構，最終導致細菌的死亡。也進一步說明了ROS在GQDs的抑菌作用中扮演著十分重要的角色。

(a) DCFH

(b) DCFH+GQDs圖9 活性氧熒光檢測Fig.9 Reactive oxygen species fluorescence

綜上所述，GQDs對大腸桿菌的抑菌作用是由光熱效應和光動力效應共同作用的。由圖7可知，只在溫度作用下時，大腸桿菌濃度只有些許的降低，而圖8中，GQDs在光動力效應下則可以使細菌濃度為0，完全地殺滅細菌。由此可說明，在GQDs的抑菌過程中，光動力效應占主導作用。

2.5.2 GQDs對大腸桿菌細胞膜的作用

為研究GQDs自身結構對大腸桿菌的破壞作用，對石墨烯量子點進行掃描電鏡分析，如圖10所示，石墨烯量子點邊緣鋒利，細菌細胞與石墨烯類材料接觸后，細菌細胞被納米片層包裹，其鋒利的外表對大腸桿菌的外表造成破壞而發(fā)生不可逆的損傷[25]。

圖10 GQDs掃描電鏡圖Fig.10 SEM of GQDs

為研究GQDs對大腸桿菌細胞膜的破壞作用，將其與0.6 mg·mL-1的GQDs共同培養(yǎng)12 h后，經(jīng)過固定脫水等處理后用掃描式電子顯微鏡觀察大腸桿菌形貌，通過對照組和實驗組的大腸桿菌形貌上變化，分析GQDs與大腸桿菌的相互作用過程，探究GQDs對大腸桿菌的抑菌機制，結果如圖11所示。

由圖11(a)可知，正常情況下，大腸桿菌呈現(xiàn)出規(guī)則的短棒狀結構、表面光滑，且細胞膜結構完整。相比之下，大腸桿菌與GQDs接觸后，如圖11(b)所示，大腸桿菌則出現(xiàn)變形、凹陷、細胞膜破裂等情況，表面也變得粗糙。而這些形態(tài)的變化是由于大腸桿菌與GQDs的接觸過程中，GQDs鋒利的外表導致大腸桿菌細胞結構的完整性被其破壞，GQDs的光熱效應和光動力效應產(chǎn)生的ROS，破壞了大腸桿菌的新陳代謝，胞內(nèi)的物質(zhì)，比如離子，蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)等發(fā)生了泄露，而導致大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生異常，從而達到了抑制大腸桿菌生長的效果。

(a)對照組

(b) 濃度為0.6 mg·mL-1的GQDs圖11 大腸桿菌掃描電鏡圖Fig.11 Scanning electron microscopy of Escherichia coli

3 結論

(1)采用震蕩沖擊法制備GQDs，可有效解決GQDs量產(chǎn)困難的缺點，提高GQDs的制備效率，降低制作成本。

(2)在808 nm激光照射下，探究GQDs抑菌特性，結果表明：GQDs能有效地抑制大腸桿菌的生長，光照時間和GQDs質(zhì)量濃度對GQDs抑菌作用都有影響。光照時間一定，大腸桿菌的生存率隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而減小，而當GQDs質(zhì)量濃度不變時，大腸桿菌的存活率隨光照時長的增加而降低。若增大GQDs質(zhì)量濃度或光照時長，可有效提高GQDs的殺菌效率。

(3)掃描電鏡和熒光檢測分析結果表明：GQDs的抑菌效果是由GQDs的光熱效應、光動力效應以及GQDs自身結構的共同作用。GQDs在光熱效應和光動力效應下產(chǎn)生的ROS與大腸桿菌胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生氧化作用，對細胞膜造成破壞，同時，GQDs鋒利的邊緣結構破壞細菌細胞結構的完整性，從而抑制細菌的生長。

(4)而石墨烯量子點在抑菌過程中，主要依靠ROS對細菌細胞膜的破壞起到殺滅細菌的作用，因此，·OH的產(chǎn)生過程、檢測方法、影響因素，以及光熱效應的增強情況等是我們進一步探索的方向和研究內(nèi)容。