陳 炯，酈特軍，鄧 卉，陳曉燕，邱振軍

(1.紹興第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 紹興 312000；2.重慶市中醫(yī)院 婦科，重慶 400011；3.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病原因?yàn)殚L(zhǎng)期的高血糖導(dǎo)致腎臟血管損傷，繼而引發(fā)腎功能障礙。石榴提取物含有豐富多樣的多酚類物質(zhì)，石榴多酚可以預(yù)防和治療癌癥、心血管和炎癥疾病。此外，研究表明石榴花多酚可降低鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗，改善大鼠血脂、肝糖原含量及抗氧化狀態(tài)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASMase)是神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的一種必需酶，參與了多發(fā)性硬化癥、糖尿病、腎臟病和脂質(zhì)代謝紊亂等各種疾病的發(fā)生發(fā)展。下調(diào)ASMase可減輕糖尿病大鼠血管內(nèi)皮胰島素抵抗，因此，抑制ASMase活性可能是治療和預(yù)防糖尿病及相關(guān)腎損傷的一種新的治療策略。本研究旨在探究石榴花多酚通過抑制ASMase和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)大鼠糖尿病腎損傷的作用，以期明確石榴花多酚在糖尿病中的作用，為糖尿病的治療提供新的科學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只6周齡雄性SD大鼠，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2018-0003)，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及使用均通過重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑 石榴花多酚由中科院新疆理化所提供；地昔帕明和鏈脲佐菌素(STZ)購自美國(guó)Sigma公司；大鼠尿素氮(BUN)和血肌酐(S-Cr)檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；尿蛋白檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Masson試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購自德國(guó)Roche；ASM抗體和CHOP抗體購自美國(guó)Cell Signaling Technology；GRP78抗體購自英國(guó)Abcam公司；GAPDH和HRP標(biāo)記二抗購自武漢Proteintech公司；SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購自日本TAKARA公司。

1.3 模型建立及分組 40只6周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、石榴花多酚組和地昔帕明組，每組各10只。對(duì)照組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)4周。其余組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射STZ(30 mg/kg)，對(duì)照組大鼠注射等量溶劑，72 h后空腹血糖水平≥16.7 mmol/L即表示造模成功。模型組、石榴花多酚組和地昔帕明組大鼠仍用高脂飼料喂養(yǎng)。石榴花多酚組大鼠灌胃石榴花多酚(300 mg/kg/d)，地昔帕明組大鼠灌胃地昔帕明(10 mg/kg/d)(ASMase抑制劑)，對(duì)照組和模型組灌胃生理鹽水，持續(xù)8周。

1.4 血糖、血清尿素氮和血肌酐檢測(cè) 給藥結(jié)束后，各組大鼠尾靜脈抽取血液標(biāo)本，血糖測(cè)試儀檢測(cè)空腹血糖水平。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，眼球采血，收集血液，1 000 g離心10 min收集血清，根據(jù)大鼠尿素氮(BUN)ELISA試劑盒和大鼠血肌酐(S-Cr)ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組大鼠血清BUN和S-Cr水平。

1.5 24 h尿蛋白含量測(cè)定 各組大鼠末次灌胃結(jié)束后，收集24 h尿液，根據(jù)尿蛋白檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白含量。

1.6 細(xì)胞學(xué)觀察 1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后取腎組織，4%多聚甲醛固定過夜。組織梯度酒精脫水透明，組織浸蠟、包埋、切片。采用PAS染色、Masson染色觀察大鼠腎組織細(xì)胞病理學(xué)變化，并于鏡下用微測(cè)量尺測(cè)定垂直徑，腎小球的體積是腎小球面積的三分之二次方的 1.25 倍。TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況，凋亡的細(xì)胞在經(jīng)染色后其細(xì)胞核被染為棕褐色，正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，即為細(xì)胞凋亡率。

1.7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物觀察 免疫組化觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78蛋白和CHOP蛋白的表達(dá)情況，RT-PCR檢測(cè) CHOP和GRP78 mRNA表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，2法計(jì)算CHOP和GRP78 mRNA表達(dá)。

1.8 Western blot檢測(cè)ASMase蛋白表達(dá) 1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，取腎臟。把腎臟組織剪切成細(xì)小的碎片，RIPA裂解液裂解組織，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入ASMase(1∶2 000)抗體和GAPDH(1∶5 000)抗體，4 ℃條件下過夜孵育。加入HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度掃描，以 β-actin 作為內(nèi)參，分析結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較采用單向方差分析，<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo) 各組大鼠血糖、BUN、Scr和24 h尿蛋白水平檢測(cè)結(jié)果見表1。與對(duì)照組相比，模型組大鼠血糖水平、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量顯著升高；與模型組相比，石榴花多酚組和地昔帕明組大鼠血糖水平、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量顯著降低；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

表1 各組大鼠血糖水平、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量

2.2 DN大鼠腎組織病理變化 與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎小球體積增大并出現(xiàn)大量藍(lán)染膠原纖維，系膜基質(zhì)擴(kuò)張，系膜細(xì)胞增生，基底膜輕度增厚，見封三圖1、圖2。石榴花多酚組和地昔帕明組大鼠的腎小球體積均小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腎小球體積

2.3 DN大鼠腎細(xì)胞凋亡情況 模型組大鼠腎細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，石榴花多酚組和地昔帕明組大鼠腎細(xì)胞凋亡率低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。見表3。各組大鼠腎細(xì)胞凋亡情況見圖1。

表3 各組大鼠腎細(xì)胞凋亡率

圖1 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠腎細(xì)胞凋亡(×400)

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)情況 各組大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78蛋白和CHOP蛋白的表達(dá)情況見封三圖3、圖4。石榴花多酚組和地昔帕明組大鼠腎臟GRP78和CHOP 的mRNA和蛋白表達(dá)均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78和CHOP的表達(dá)

2.5 DN大鼠酸性神經(jīng)鞘磷脂酶的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、石榴花多酚組和地昔帕明組大鼠的腎臟ASMase蛋白表達(dá)水平分別為(1.00±0.07)、(4.20±0.42)、(2.35±0.37)、(2.53±0.30)，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=51.288，<0.001)，模型組最高。見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠腎臟ASMase表達(dá)

3 討論

糖尿病腎病(DN)是終末期腎功能衰竭的主要原因，是全球糖尿病患者發(fā)病率和死亡率的主要因素，表現(xiàn)為腎小球肥大、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白沉積、系膜基質(zhì)和腎小球基底膜擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)纖維化、蛋白尿失量過大和廢物清除功能隨時(shí)間推移而喪失。事實(shí)上，大多數(shù)糖尿病患者的心血管疾病死亡率與糖尿病腎病有關(guān)。

石榴花是我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥，具有很強(qiáng)的抗氧化能力。石榴在某些傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)體系中被認(rèn)為是一種降糖藥，石榴花提取物可以有效地降低血糖和保護(hù)肝臟。然而，石榴花提取物在糖尿病中的作用還有待繼續(xù)探討。石榴多酚在預(yù)防代謝相關(guān)疾病如肥胖、糖尿病和相關(guān)并發(fā)癥方面具有有益作用。研究表明，石榴皮提取物能有效改善STZ誘發(fā)的C57BL/6小鼠1型糖尿病的臨床癥狀。石榴汁可減少氧化應(yīng)激和鉀的消耗，減輕卡托普利和慶大霉素誘導(dǎo)的腎毒性作用，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞在應(yīng)激環(huán)境下的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是腎臟疾病的標(biāo)志。已有研究證明，石榴花多酚對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗具有改善作用，改善大鼠血脂、肝糖原含量及抗氧化狀態(tài)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究結(jié)果顯示，石榴花多酚可降低糖尿病大鼠血糖，改善腎臟病理組織學(xué)變化，抑制腎細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

研究表明，ASMase途徑可促進(jìn)腎小球硬化疾病進(jìn)程。此外，高血糖通過增強(qiáng)ASMase活性，提高糖尿病大鼠神經(jīng)酰胺水平，最終導(dǎo)致大鼠腎臟損傷。另有研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜血管中ASMase被激活，并且ASMase的抑制可以作為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在治療策略。抑制ASMase表達(dá)，可以改善糖尿病小鼠血管功能障礙。本研究以地昔帕明(ASMase抑制劑)為陽性對(duì)照，觀察石榴花多酚對(duì)ASMase的影響，結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎臟中ASMase表達(dá)升高，石榴花多酚或地昔帕明治療可抑制ASMase的表達(dá)，地昔帕明治療也可抑制糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，該結(jié)果說明，石榴花多酚可能通過抑制ASMase進(jìn)而抑制糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而阻礙糖尿病腎病疾病進(jìn)展。

綜上所述，石榴花多酚可抑制糖尿病大鼠腎臟ASMase表達(dá)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕糖尿病大鼠腎損傷。該研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解石榴花多酚在糖尿病腎病中的作用，為糖尿病腎病的治療提供新的科學(xué)資料。