索江華，唐桂芬，黃 鋒，李新峰，張曉靜

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046； 2.河南省永城市畜牧局，河南 永城 476610)

在釀酒過程中，小麥糖化率低主要是由于麩皮中粗纖維含量高所導致，適當添加纖維素酶可以顯著地提高出酒率，并能縮短發(fā)酵時間[1-4]。為了提高小麥釀酒效率，本研究通過對配制復合纖維素酶降解麩皮的條件進行優(yōu)化，為后續(xù)提高小麥出酒率提供理論支持。

1 材料與試劑

小麥麩于(105±2)℃烘至恒質量，過0.425 mm篩網(wǎng)。纖維素酶的酶活為30 000 U/g。

葡萄糖、檸檬酸、3,5-二硝基水楊酸等均為國產(chǎn)分析純。

2 試驗方法

2.1 繪制葡萄糖標準曲線

2.1.1 葡萄糖標準貯備溶液的配制

準確稱取(105±2) ℃下烘干至恒質量的無水葡萄糖1 g，加pH值為5.6的檸檬酸鹽緩沖溶液攪拌至完全溶解，定容至100 mL，使其質量濃度為10 mg/mL。

2.1.2 葡萄糖標準的曲線繪制

用檸檬酸鹽緩沖液將2.1.1配成質量濃度為0、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液，按照3,5-二硝基水楊酸法測還原糖含量[5]。以還原糖含量為縱坐標，吸光度值為橫坐標繪制標準曲線。

2.2 還原糖測定

采用3，5-二硝基水楊酸試劑法檢測還原糖含量。

2.3 單因素試驗設計

以還原糖含量為評價指標，分別以不同梯度的酶濃度、pH值、溫度和反應時間為研究對象，觀察復合纖維素酶對小麥麩中纖維素降解工藝的影響。

2.3.1 酶濃度對纖維素酶催化效果的影響

將1.0 mL pH值為5.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液加入0.02 g小麥麩樣品，分別加入濃度為30、60、90、120、150 U/mL的纖維素酶各0.5 mL,于50 ℃的水浴鍋中反應1 h，每組實驗設3個重復，以確定纖維素酶的最佳工作濃度。

2.3.2 pH值對纖維素酶催化效果的影響

取 0.02 g的小麥麩樣品分別加入pH值為3.0、3.6、4.6、5.6、6.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液1.0 mL及酶濃度為120 U/mL的纖維素酶0.5 mL，于50 ℃的水浴鍋中反應1 h，每組實驗設3個重復，以確定纖維素酶的最適pH值。

2.3.3 溫度對纖維素酶催化效果的影響

取0.02 g小麥麩樣品加入1.0 mL pH值為4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，隨后加入0.5 mL酶濃度為120 U/mL的纖維素酶，分別于40、45、50、55、60 ℃的水浴反應1 h，每組實驗設3個重復，以確定纖維素酶的最佳反應溫度。

2.3.4 反應時間對纖維素酶催化效果的影響

取0.02 g小麥麩樣品，加入1.0 mL pH值為4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液及0.5 mL 120 U/mL的纖維素酶，于50 ℃水浴反應的1、6、12、18、24 h，每組實驗設3個重復，以確定纖維素酶的最佳反應時間。

2.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016軟件對單因素試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析，利用軟件Design Expert 8.06對響應面試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析，以確定模型和因素的顯著性[8]。

2.4 響應面法對降解條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果，確定各因素的優(yōu)化水平。以還原糖含量作為響應值，采用Box-Behnken法設計纖維素酶降解小麥麩的工藝條件，進行四因素三水平的響應面分析試驗，因素與水平編碼值見表1[6,7]。

表1 響應面試驗設計因素與水平

3 試驗結果與分析

3.1 葡萄糖標準曲線

根據(jù)2.1.2方法建立吸光度值與葡萄糖含量之間線性關系如圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 酶濃度對纖維素酶催化效果的影響

由圖2可知,隨著酶濃度的增大,還原糖含量逐漸升高。當酶濃度為120 U/mL時，還原糖含量最大(122.81 mg/L)；酶濃度繼續(xù)增大還原糖含量明顯下降。最佳酶濃度為120 U/mL。

圖2 酶濃度對小麥麩還原糖含量的影響

3.2.2 pH值對纖維素酶催化效果的影響

由圖3可知，隨著pH值增大還原糖濃度逐漸增大，pH值在3.0～4.6時，小麥麩中還原糖的量增至138.14 mg/L；當pH繼續(xù)增大時，還原糖濃度顯著。因此，確定最適pH值為4.6。

圖3 pH值對小麥麩還原糖含量的影響

3.2.3 溫度對纖維素酶催化效果的影響

由圖4可知，隨著溫度的升高，還原糖含量逐漸增大。當溫度在40～50 ℃時，小麥麩中還原糖含量增至80.20 mg/L；隨著溫度繼續(xù)升高，還原糖含量顯著下降，因此確定最適反應溫度為50 ℃。

圖4 溫度對小麥麩還原糖含量的影響

3.2.4 反應時間對纖維素酶催化效果的影響

由圖5可知，隨著酶反應時間的延長還原糖含量逐漸增大。當酶反應時間在1～18 h時，小麥麩中還原糖含量增至142.42 mg/L，隨著酶反應時間的延長，還原糖含量略有下降。因此，確定最適反應時間為18 h。

圖5 酶反應時間對小麥麩還原糖含量的影響

3.3 響應面法優(yōu)化試驗

3.3.1 二次響應面回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素試驗，以還原糖含量Y作為響應值，利用Design-Expert 8.06進行響應面試驗設計，結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計方案與結果

續(xù)表2 Box-Behnken試驗設計方案與結果

3.3.2 回歸模型的建立

用Design-Expert 8.06軟件對表2的結果進行二次多元回歸擬合，得到以還原糖含量為響應函數(shù)和建立各參數(shù)編碼值的二次響應面回歸模型：Y=110.73+7.47A+4.76B-2.22C-5.21D+3.39AB+5.46AC-6.94AD+11.57BC-3.42BD+6.96CD-24.96A2-15.76B2-18.12C2-18.59D2

由表3可以得出，本試驗的二次多項模型顯著(P<0.05)，失擬項不顯著(P>0.1)，回歸方程決定系數(shù)R2=0.951，表示該模型解釋了95.40%的響應值變化，方程擬合程度較好，可以用作纖維素酶對小麥麩中纖維素降解條件進行分析和預測。

表3 回歸模型的方差分析

3.3.3 響應面分析和優(yōu)化

為分析各因素在交互項上對纖維素酶降解小麥麩效果的影響，利用Design-Expert 8.06分析軟件對回歸方程進行運算，得出各因素交互項的響應面(圖6)。

(a)溫度和時間不變，酶濃度和pH值交互作用對還原糖含量的影響；(b)溫度和pH值恒定，酶濃度和酶反應時間交互作用對還原糖含量的影響；(c)pH值和時間恒定，酶濃度和溫度交互作用對還原糖含量的影響；(d)溫度和酶濃度恒定，pH值和酶反應時間交互作用對還原糖含量的影響；(e)酶濃度和酶反應時間恒定，pH值和溫度交互作用對還原糖含量的影響；(f)酶濃度和pH值恒定，酶反應時間和溫度交互作用對還原糖含量的影響。圖6 各因素間交互作用對小麥麩還原糖含量的影響

a圖顯示酶反應時間為18 h，溫度為50 ℃時，酶濃度與pH值的交互作用對小麥麩中纖維素降解成還原糖的影響。還原糖含量的最大區(qū)域位于酶濃度114～138 U/mL，pH值在4.1～5.1。b圖顯示，pH值為4.6，溫度為50 ℃時，酶濃度為114～132 U/mL，酶反應時間在15～21 h，還原糖含量最大。c圖顯示，pH值為4.6，酶反應時間為18 h，酶濃度為102～144 U/mL，溫度在45～53 ℃，還原糖含量最大。d圖顯示，酶濃度為120 U/mL，溫度為50 ℃時，pH值為3.6～5.6，酶反應時間在12～24 h，還原糖含量最大。e圖顯示，酶濃度為120 U/mL，酶反應時間為18 h，pH值為4.1～5.1，溫度在47～51 ℃，還原糖含量最大。f圖顯示，酶濃度為120 U/mL，pH值為4.6時，酶反應時間為15～21 h，溫度在47～51 ℃，還原糖含量最大。

最終確定纖維素酶對小麥麩中纖維素降解的最優(yōu)條件為酶濃度為125 U/mL、pH 值為4.8、酶反應時間為18 h、反應溫度為48 ℃，小麥麩中還原糖含量最大為114.31 mg/L。

3.4 驗證試驗

根據(jù)響應面優(yōu)化得到各因素最佳參數(shù)為優(yōu)化結果，確定最佳降解工藝條件是pH值為4.8，酶濃度為125 U/mL，溫度為48 ℃、反應時間為18 h，這時小麥麩中還原糖含量平均值為114.31 mg/L。本研究得到的還原糖含量相對于理論數(shù)據(jù)誤差為2.04 mg/L，表明響應面所得的最佳組合適用于復合纖維素酶降解小麥麩生成還原糖，試驗可行。

4 結論

纖維素酶是一組復合酶，可以通過外切酶和內(nèi)切酶作用破壞原料中不溶性纖維素鏈狀結構，逐步釋放出還原糖，以利于酒曲中酵母將還原糖發(fā)酵為乙醇。在釀酒前添加纖維素酶有利于提高原料的出酒率[9]。本試驗以小麥纖維素含量最高的種皮為研究對象，在復合纖維素酶單因素試驗研究的基礎上，通過響應面分析得出酶最佳降解條件：酶濃度為125 U/mL、pH值是4.8、溫度為48 ℃、酶反應時間為18 h，這時小麥麩中還原糖含量為114.31 mg/L。未經(jīng)纖維素酶處理的小麥麩還原糖含量為48.25 mg/L，復合纖維素酶處理組還原糖含量提高了137%。