辛 婷，郭瀟揚(yáng)，王 釗，蘇 楠

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題一直被人們密切關(guān)注，食品在加工、貯藏以及運(yùn)輸過(guò)程中容易受到腐敗微生物的污染，導(dǎo)致感官品質(zhì)下降或者腐敗變質(zhì)。在食品工業(yè)化生產(chǎn)中，為了預(yù)防食品變質(zhì)和延長(zhǎng)保質(zhì)期，常常采用添加防腐劑的方法。常用的防腐劑大多為化學(xué)制劑，長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人體健康造成危害，因此，尋找新型替代品已成為目前的研究熱點(diǎn)。

乳酸菌素能夠使食品保持原有的風(fēng)味和組織狀態(tài)，抑制病原菌及腐敗菌的生長(zhǎng)，最終達(dá)到防腐和延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的效果[1]。研究表明，乳酸菌及乳酸菌素對(duì)肉制品、乳制品、水產(chǎn)品、面包等均能起到良好的保鮮作用，目前研究最多且應(yīng)用最廣泛的是乳酸鏈球菌素，它已被50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用[2]。

乳酸菌素作為一種天然防腐劑，應(yīng)用范圍非常廣闊，如將乳酸菌素直接添加到食品中，不僅可以起到有效的防腐作用，還可以增加食品風(fēng)味；將其制成保健品用于醫(yī)藥工業(yè)，可有效改善胃腸道功能、增加機(jī)體免疫力。將乳酸菌作為發(fā)酵劑添加到泡菜、酸菜、酸奶等發(fā)酵食品中，同樣能起到抑菌作用。

本研究主要從發(fā)酵食品中分離并篩選出有廣譜抑菌作用的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，以期得到天然的具有食品防腐潛力的細(xì)菌素，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

光明暢優(yōu)風(fēng)味發(fā)酵乳、花花牛益生菌風(fēng)味發(fā)酵乳、伊利牧場(chǎng)清晨風(fēng)味發(fā)酵乳、光明植物活力乳酸菌飲料、養(yǎng)樂多活菌型乳酸菌飲料、孝感米酒、海天蘋果醋、海天黃豆醬、聚味特蘿卜條及各種家庭自制泡菜(西瓜醬、酸白菜、黃瓜條、糖蒜等)。

指示菌株大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌均由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試驗(yàn)試劑

MRS培養(yǎng)基、牛肉膏、酵母浸粉、緩沖蛋白胨均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，氯化鈉、碳酸鈣、葡萄糖、吐溫80、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂(粉)、乳酸、氫氧化鈉、鹽酸均購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠，過(guò)氧化氫酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器及設(shè)備

微量高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)、智城恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、生化培養(yǎng)箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、電熱式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(金壇市希望科研儀器有限公司)、漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩、分離純化

準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)所選酸奶、乳酸菌飲料、米酒、蘋果醋、黃豆醬、蘿卜條及家庭自制泡菜，將樣品與MRS液體培養(yǎng)基按照1∶10的比例進(jìn)行混合增菌，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)17 h，用生理鹽水制備成梯度稀釋液，移取200 μL適宜的梯度稀釋液，涂布接種于含1.0%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h[3]。

從初篩的菌株中挑取周圍有透明溶鈣圈的單個(gè)菌株，在含碳酸鈣的培養(yǎng)基中用平板劃線法將其進(jìn)行分離純化，37 ℃培養(yǎng)48 h。取1環(huán)菌苔接種于LB固體斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，將其放置到4 ℃冰箱中備用。

2.2 試驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液的制備

從純化后的試驗(yàn)菌株中挑取3環(huán)菌苔接種于MRS液體培養(yǎng)基中制成種子液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，將種子液與MRS液體培養(yǎng)基按照1∶50的比例混勻，37 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h后，置于4 ℃、5 000 r/min的條件下離心15 min，取發(fā)酵上清液備用[4]。

2.3 指示菌菌懸液的制備

以大腸桿菌為例，其他4種指示菌沙門氏菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌皆采用同樣的方法制備。取1環(huán)大腸桿菌接種到LB固體斜面培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，然后挑取3環(huán)菌苔接種到LB液體培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃、120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，再將指示菌菌懸液進(jìn)行適宜的梯度稀釋，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹4]。

2.4 抑菌試驗(yàn)

采用雙層瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[5]，通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑的大小來(lái)判斷乳酸菌的抑菌效果。具體的試驗(yàn)操作流程如下(以大腸桿菌為例)。

培養(yǎng)皿底層傾注15 mL左右的LB固體培養(yǎng)基→待其完全凝固后均勻放置3個(gè)牛津杯→準(zhǔn)確移取100 μL大腸桿菌菌懸液與10 mL(滅菌后溫度保持在50 ℃左右)LB半固體培養(yǎng)基均勻混合→倒平板→待培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯→在打好的孔內(nèi)加入70 μL試驗(yàn)菌株的發(fā)酵上清液→4 ℃冰箱中靜置擴(kuò)散3 h→37 ℃培養(yǎng)12 h→測(cè)量抑菌圈的直徑→求其平均值→記錄數(shù)據(jù)。

2.5 抑菌物質(zhì)的確定

2.5.1 有機(jī)酸排除試驗(yàn)

用乳酸將MRS液體培養(yǎng)基調(diào)至與試驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液相同的pH值，以志賀氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。若上清液的抑菌圈直徑大于同pH值乳酸抑菌圈的直徑，則認(rèn)為發(fā)酵上清液所起的抑菌作用不完全是由有機(jī)酸引起[6]。

2.5.2 過(guò)氧化氫排除試驗(yàn)

將過(guò)氧化氫酶用0.05 mol/L(pH值為7.0)磷酸鹽緩沖溶液溶解配置成10 mg/mL的酶溶液，再將配好的酶溶液與同pH值的發(fā)酵上清液等體積混合，使過(guò)氧化氫酶溶液的最終質(zhì)量濃度為5 mg/mL。37 ℃水浴2 h后調(diào)回原發(fā)酵上清液的pH值，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以未經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的發(fā)酵上清作為空白對(duì)照[7]。

2.5.3 蛋白酶敏感試驗(yàn)

將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分別用pH值為7.6、6.0、2.0的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液配置成2 mg/mL的酶溶液，同時(shí)將發(fā)酵上清液調(diào)至各蛋白酶的最適pH值，將發(fā)酵上清液與蛋白酶溶液按照1∶1的比例混合勻，37 ℃水浴2 h后調(diào)回原發(fā)酵上清液的pH值，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以未經(jīng)蛋白酶處理的發(fā)酵上清液作為空白對(duì)照[8]。

2.6 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

2.6.1 菌落形態(tài)

在無(wú)菌條件下挑取1環(huán)抑菌效果最佳的菌株接種于10 mL的無(wú)菌生理鹽水制備成菌懸液。充分混勻后移取200 μL菌懸液涂布接種到MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h。觀察該菌株的菌落形態(tài)、色澤、大小、質(zhì)地以及邊緣等基本特征，隨后挑取1環(huán)菌苔進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌落的染色情況。其中革蘭氏染色步驟如下。

載玻片中央滴加1滴無(wú)菌生理鹽水→挑取1環(huán)菌苔在水滴中涂勻→自然晾干→草酸銨結(jié)晶紫初染1 min→水洗→碘液媒染1 min→水洗→95%乙醇脫色30 s→水洗→復(fù)紅復(fù)染1 min→水洗→自然晾干→鏡檢→油鏡下觀察菌落的個(gè)體形態(tài)。

2.6.2 生理生化試驗(yàn)

以《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[9]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]中乳酸菌生理生化鑒定試驗(yàn)要求為參考依據(jù)，對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定，其中生理生化試驗(yàn)主要包括以下幾個(gè)方面[11-14]：

(1)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)

載玻片中央滴加1滴10%的H2O2，挑取1環(huán)菌苔在H2O2上涂勻，觀察是否有氣泡產(chǎn)生，若有氣泡則為陽(yáng)性反應(yīng)(用+表示)，反之為陰性(用-表示)。

(2)明膠液化試驗(yàn)

將供試菌株采用穿刺的方法接種于明膠培養(yǎng)基中，置于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，空白對(duì)照不接菌。由于明膠培養(yǎng)基的組織狀態(tài)對(duì)溫度較為敏感，≥24 ℃呈液態(tài)，≤20 ℃呈固態(tài)。因此，在觀察時(shí)應(yīng)進(jìn)行低溫處理，觀察試驗(yàn)管是否液化。若試驗(yàn)管液化，則說(shuō)明為陽(yáng)性反應(yīng)(用+表示)，反之為陰性(用-表示)。

(3)吲哚試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株接種于緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中，以未接菌的試管為空白對(duì)照，將其置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)基中加入1 mL乙醚充分振蕩，靜置幾分鐘，待培養(yǎng)液與乙醚出現(xiàn)分層時(shí)，沿著試管壁加入10滴吲哚試劑，觀察乙醚層的變色情況。如果乙醚層呈玫瑰紅色，說(shuō)明試驗(yàn)菌株能夠產(chǎn)生吲哚，視為陽(yáng)性反應(yīng)(用+表示)，反之為陰性(用-表示)。

(4)淀粉水解試驗(yàn)

根據(jù)淀粉遇碘變藍(lán)的原理，將試驗(yàn)菌株接種到淀粉培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h，滴加少量碘液于培養(yǎng)基表面，緩慢旋轉(zhuǎn)平皿，使碘液鋪滿整個(gè)平板，觀察平板上的顏色變化。如果培養(yǎng)基呈藍(lán)黑色，菌落周圍無(wú)色則表明淀粉水解為陽(yáng)性反應(yīng)(用+表示)，反之為陰性(用-表示)。

(5)乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(VP實(shí)驗(yàn))

將試驗(yàn)菌株接種到葡磷胨水生化管中，同時(shí)以未接菌的生化管作為空白對(duì)照，封口后置37 ℃培養(yǎng)48 h。滴加甲液(6% α-萘酚酒精溶液)和乙液(40% KOH溶液)，幾分鐘后若試驗(yàn)管呈紅色則為陽(yáng)性反應(yīng)(用+表示)，反之為陰性(用-表示)。

(6)糖發(fā)酵試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株接種于各類糖發(fā)酵生化管中，以未接菌的糖發(fā)酵生化管作為空白對(duì)照，封口后置37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)液的顏色變化。若呈黃色為陽(yáng)性反應(yīng)(用+表示)，反之為陰性(用-表示)。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩結(jié)果

將增菌培養(yǎng)后的樣品采用涂布的方法接種于含碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基，菌落周圍產(chǎn)生透明溶鈣圈的菌株則為試驗(yàn)菌株[15]，試驗(yàn)初步篩選得到13株有溶鈣圈的菌株，并將其編號(hào)為A1～A13。

3.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

將初步篩選出的試驗(yàn)菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，得到9株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌有抑制作用的乳酸菌。從表1的數(shù)據(jù)中可以得出，大多數(shù)乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)志賀氏菌和李斯特菌有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌圈直徑達(dá)到21 mm左右；小部分乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用也較明顯，如A5、A7、A11、A13，它們的抑菌圈直徑均在19 mm以上。從整體上看，復(fù)篩得到的9株乳酸菌A1、A2、A3、A4、A5、A7、A10、A11、A13均具有廣譜的抑菌能力。因此，選擇這9株菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 發(fā)酵離心上清液的抑菌效果 mm

3.3 抑菌物質(zhì)的確定

3.3.1 有機(jī)酸排除試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌對(duì)指示菌的抑菌效果有可能是細(xì)菌素在起作用，但也不排除是有機(jī)酸的影響，因此，在試驗(yàn)過(guò)程中需排除有機(jī)酸的干擾[16]。以志賀氏菌和李斯特菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，比較發(fā)酵上清液與同酸度乳酸之間的抑菌效果。從表2的試驗(yàn)結(jié)果可以得出，菌株A1、A3、A4、A5、A10、A11發(fā)酵上清液的抑菌圈略大于同pH值乳酸的抑菌圈，乳酸作用的比重均高于75%，說(shuō)明這6株乳酸菌所起到的抑菌作用一定程度上是由有機(jī)酸引起的[17]；而菌株A2、A7、A13發(fā)酵上清液中乳酸作用比重均低于70%，其中A2排酸后的抑菌效果最佳，說(shuō)明這3株乳酸菌對(duì)指示菌的抑制作用并不單純是由酸性物質(zhì)所引起，其中還存在其他的抑菌物質(zhì)[18]，是否是細(xì)菌素的作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，選擇A2、A7、A13 3個(gè)菌株做進(jìn)一步的過(guò)氧化氫排除試驗(yàn)。

表2 排除有機(jī)酸干擾的抑菌試驗(yàn)

3.3.2 過(guò)氧化氫排除試驗(yàn)結(jié)果

在排除有機(jī)酸的干擾后仍需進(jìn)一步排除過(guò)氧化氫所起到的抑菌作用，由表3的數(shù)據(jù)中可以看出，試驗(yàn)菌株經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后與對(duì)照組相比，抑菌活性下降，這說(shuō)明有部分抑菌作用是由過(guò)氧化氫所引起[19]。

表3 排除過(guò)氧化氫干擾后的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3.3.3 蛋白酶敏感試驗(yàn)

經(jīng)排除有機(jī)酸和過(guò)氧化氫的干擾后，通過(guò)蛋白酶敏感試驗(yàn)進(jìn)一步確定抑菌物質(zhì)的性質(zhì)。從表4的試驗(yàn)數(shù)據(jù)中可分析得出：A2、A7、A13菌株發(fā)酵上清液經(jīng)不同蛋白酶處理后，抑菌效果不同程度下降。由此可見，發(fā)酵上清液所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)，即發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)有細(xì)菌素[20]。

表4 經(jīng)不同蛋白酶處理后的抑菌試驗(yàn)結(jié)果 mm

3.4 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

3.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)有機(jī)酸、過(guò)氧化氫排除試驗(yàn)以及蛋白酶敏感試驗(yàn)得出菌株A2、A7、A13發(fā)酵上清液中含有細(xì)菌素。結(jié)合表1可知，菌株A2對(duì)5株指示劑的整體抑菌效果最佳。將A2制備成菌懸液涂布于MRS固體培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察。在MRS固體培養(yǎng)基上，菌株A2的菌落形態(tài)呈乳白色、較小的圓形、菌落表面光滑、邊緣整齊、中央微微凸起(圖1A)。經(jīng)革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在顯微鏡下觀察該菌株呈規(guī)則的桿狀，以單個(gè)或者短鏈狀的形式排列(圖1B)。

A.菌落形態(tài);B.革蘭氏染色圖1 菌株A2的形態(tài)學(xué)鑒定

3.4.2 生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

由表5生理生化試驗(yàn)結(jié)果可以得出，該試驗(yàn)菌株能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，不能夠液化明膠，不產(chǎn)生吲哚，不能夠水解淀粉，VP實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，能夠發(fā)酵葡萄糖酸鹽。由此可確定該菌株屬于兼性異型發(fā)酵菌群。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)，初步鑒定A2為植物乳桿菌。

表5 乳酸菌A2生理生化特征

4 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從多種發(fā)酵食品中篩選出9株具有一定抑菌活性的乳酸菌菌株，由于乳酸菌所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)有多種，是否是細(xì)菌素需進(jìn)一步驗(yàn)證。經(jīng)有機(jī)酸排除試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、酶敏感試驗(yàn)證實(shí)上清液中如存在蛋白質(zhì)類物質(zhì)，則認(rèn)為是細(xì)菌素[21，22]。最終，通過(guò)試驗(yàn)得到菌株A2、A7、A13能發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素，其中A2抑菌效果最佳。

菌株A2具有廣譜的抑菌性，不僅對(duì)2種常見的革蘭氏陽(yáng)性致病菌(單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌)具有很好的抑制作用，而且對(duì)3種革蘭氏陰性致病菌(大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌)的抑制效果也很顯著，尤其是抑制志賀氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的效果最佳，發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑分別達(dá)到23.33 mm和22.33 mm，高于較多文獻(xiàn)中抑菌圈直徑值。劉樹昕等[23]從新疆傳統(tǒng)酸奶中篩選出1株廣譜抑菌乳酸菌B6，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳，抑菌圈直徑為20.76 mm。沈勇等[24]從花鱸魚腸道中篩選出1株產(chǎn)細(xì)菌素糞腸球菌，發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.58 mm。劉義等[25]從西南地區(qū)泡菜汁中篩選出1株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌QH18-4，對(duì)大腸桿菌抑菌效果最佳，抑菌圈直徑小于15 mm，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌抑菌圈直徑小于10 mm。

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)，初步鑒定菌株A2為植物乳桿菌。由于生理生化試驗(yàn)具有一定的局限性，下一步將結(jié)合16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。