江青東

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 畜產(chǎn)品質(zhì)量安全技術研究院，河南 鄭州 450046)

2020年7月1日，國家明確規(guī)定嚴格禁止在飼料中添加抗生素，以確保健康養(yǎng)殖、綠色養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。同時，為提高畜禽養(yǎng)殖過程中疫病的預防和治療效果，尋找抗生素的替代品已成為當務之急。隨著科技的發(fā)展，微生物中藥發(fā)酵產(chǎn)物在畜禽疫病預防與治療過程中的顯著療效已被人們所接受。植物提取物、益生菌、抗菌肽等也是當前畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中用來代替抗生素的常用物質(zhì)[1]。

資料表明，微生物不僅分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力強，而且還能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物[2，3]。乳酸菌具有調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡、提高畜禽對飼料的吸收轉(zhuǎn)化能力及提高畜禽機體免疫力等功效[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥黨參和黃芪在經(jīng)過乳酸菌FGM9菌株發(fā)酵后，其發(fā)酵產(chǎn)物中的粗多糖含量得到明顯提高[7，8]。本文就乳酸菌FGM9菌株的毒性作用開展實驗研究，以確認其生物安全性，為其作為中藥發(fā)酵菌種奠定基礎。

1 試驗材料

1.1 供試動物

64只健康SPF小鼠，體重約25 g左右，雌雄各32只。試驗分8組，每組8只，雌雄各4只，飼養(yǎng)于小鼠籠，常溫下飼養(yǎng)7 d后開始試驗。

1.2 試驗菌株

乳酸菌FGM9由河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.3 試驗儀器設備

血液分析儀購自日本希森美康醫(yī)用電子有限公司、精密天平購自北京愛尚陽光科技有限公司、冷凍離心機購自鑫貝西科學儀器有限公司，厭氧罐購自北京緣生化科技有限公司、全溫振蕩培養(yǎng)箱購自成都精密設備有限公司。

1.4 培養(yǎng)基及菌液的配制

1.4.1 MRS瓊脂

將檸檬酸三銨1.5 g、K2HPO42.0 g、MgSO40.25 g、酵母膏6.0 g、葡萄糖25.0 g、瓊脂粉15.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏12.0 g、MnSO40.1 g、三水合乙酸鈉6.0 g溶解于1 000 mL蒸餾水，調(diào)整pH值為6.5，高壓滅菌備用。

1.4.2 MRS肉湯

將酪蛋白酶15.0 g、葡萄糖25.0 g、MnSO40.1 g、乙酸鈉5.5 g、MgSO40.25 g、牛肉膏15.0 g、檸檬酸三銨2.5 g、酵母膏5.0 g、K2HPO42.5 g、吐溫80 1.0 mL溶解于1 000 mL蒸溜水，調(diào)整pH值為5.7，高壓滅菌備用。

1.4.3 菌液配制

將已活化的FGM9菌株接種于配制好的MRS肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。4 000 r/min離心20 min,棄去上清液,用滅菌的0.9% NaCl溶液配制低、中、高3個濃度的灌胃組菌懸液，濃度分別為5×106、5×108、5×1010cfu/mL。吸取在MRS瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的FGM9菌苔，用滅菌0.9% NaCl溶液配制腹腔注射組低、中、高3個濃度的菌懸液，濃度分別為6×106、6×108、6×1010cfu/mL。將以上配制好的菌懸液置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

菌液灌注前，將8組小鼠禁食12 h后分別進行稱重記錄。將已配制好的灌胃組低、中、高3個濃度的菌懸液(濃度分別為5×106、5×108、5×1010cfu/mL)分別灌胃1組，另設1個陰性對照。腹腔注射組低、中、高3個濃度的菌懸液(濃度分別為6×106、6×108、6×1010cfu/mL)分別設1個腹腔注射1組、1個陰性對照組。灌胃組每天上午10∶00和下午15∶00灌注2次，劑量為0.6 mL只/次，連續(xù)灌注7 d，陰性對照組用等量滅菌生理鹽水。腹腔注射組上午10∶00和下午15∶00注射2次，劑量為0.4 mL只/次，連續(xù)腹腔注射7 d，陰性對照組使用等量滅菌生理鹽水。

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用X±SD表示,采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析,多組間比較用方差分析F檢驗，組間比較采用SNK檢驗。

4 結果與分析

4.1 體重變化

試驗結果顯示，試驗組和對照組小鼠的體重增加符合正常生長規(guī)律，其中灌胃組的中劑量組和腹腔注射的低劑量組小鼠體重顯著增加(P<0.05)，分別高于空白對照組。結果見表1。

表1 小鼠體重變化

4.2 臟器系數(shù)變化

對試驗組和對照組小鼠的內(nèi)臟器官的(胸腺、脾臟及肝臟系數(shù))變化情況進行比較，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，灌胃組、腹腔注射低劑量組和中劑量組的胸腺系數(shù)與對照組相比均差異顯著(P<0.05)；灌胃和腹腔注射的高劑量組的脾臟系數(shù)與對照組相比差異顯著(P<0.05)；其他均無顯著差異，結果見表2。

表2 小鼠胸腺、脾臟和肝臟系數(shù)變化

臟器系數(shù)=臟器重/體重×100%

4.3 血液指標變化

腹腔注射組血液中各個指標及灌胃組血液中各個指標均差異不顯著(P<0.05)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，灌胃各組紅細胞、血紅蛋白的平均值略高于腹腔注射組。結果見表3、表4。

表3 腹腔注射組血液中各個指標變化

表4 灌胃組血液中各個指標變化

5 討論與結論

乳酸菌是一種能發(fā)酵多種碳水化合物的益生菌，在畜禽飼料、食品中應用較為廣泛，其在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生各種具有抑菌作用的高活性物質(zhì)，如酶、小分子肽及細菌素等，能減少胃腸道腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡，提高畜禽機體免疫應答能力[9-11]。乳酸菌作為抗生素替代物不僅具有成本低、安全性能好、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)工藝成熟等諸多優(yōu)點，而且應用形式靈活。若其添加在飼料中發(fā)酵后能產(chǎn)生有機酸，這不僅可使飼料變得芳香濃郁，提高畜禽適口性及飼料的利用效率，而且還能降解飼料中的霉菌毒素，大大降低畜禽因飼料腐敗發(fā)生中毒的可能。

研究表明，乳酸菌不同菌株之間具有差異性，個別菌株對畜禽機體具有致病性[12-15]。因此，在用于發(fā)酵中藥或作為飼料添加劑使用之前要對其安全性進行綜合性評價。本試驗以小鼠為動物載體通過灌胃和腹腔注射兩種途徑來研究乳酸菌FGM9對其體重、組織病理學和血液學等的影響，綜合評價FGM9菌株毒性。試驗結果表明，小鼠體重增加正常，對其體內(nèi)主要臟器無病理性損傷，血液學指標正常。乳酸菌FGM9在中藥發(fā)酵用于畜禽養(yǎng)殖過程中，對畜禽健康不會產(chǎn)生負面影響，作為發(fā)酵菌株應用于畜禽養(yǎng)殖替代抗生素可行、可靠、安全。