宋慧欣,李舒柔,楊 柳,吳文琪,陳子晴,張 航,張嘉家,覃麗梅,趙孟孟

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231)

先天免疫是動(dòng)物在長(zhǎng)期種系發(fā)育和進(jìn)化過(guò)程中不斷與病原微生物斗爭(zhēng)逐漸形成的一系列機(jī)體防御機(jī)制，是機(jī)體非特異性地抵抗外來(lái)病原微生物感染的第一道防線。先天免疫模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)可識(shí)別一種或多種病原相關(guān)分子模式[1]，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素(Interferon，IFN)等免疫相關(guān)因子的生成，從而調(diào)節(jié)先天免疫。PRRs信號(hào)通路易被激活或調(diào)節(jié)，在先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)中都具有重要作用[2]。I型干擾素(IFN-I)是先天免疫系統(tǒng)早期對(duì)抗病毒感染的重要細(xì)胞因子，IFN誘導(dǎo)基因(IFN stimulated genes，ISGs)被IFN-I激活后表達(dá)，能增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力。干擾素調(diào)控分子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)是IFN-I通路的關(guān)鍵信號(hào)分子之一，宿主和病毒均可通過(guò)對(duì)IRF3蛋白功能的調(diào)控有效拮抗或促進(jìn)IFN-I的產(chǎn)生[3]。

三聯(lián)基序(Tripartite motif，TRIM)是一組高度保守的E3泛素連接酶蛋白，參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生，其功能失調(diào)可導(dǎo)致癌癥、免疫疾病或發(fā)育障礙等[4]。TRIM蛋白家族N端都具有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域RING、B-Box和Coiled-coil(即RBCC結(jié)構(gòu)域)[5,6]，其中RING結(jié)構(gòu)域在泛素化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。根據(jù)其多變的C端結(jié)構(gòu)域可以將該家族劃分為11種亞類[7,8]，且不同結(jié)構(gòu)的TRIM分子生物學(xué)功能存在差異[9]。TRIM蛋白多數(shù)見于真核生物，其成員總數(shù)與物種進(jìn)化的程度有關(guān)，例如，在人體中有80多種成員[10-14]，豬中有61種[15]，小鼠中約有64種，蟲類中約有20種，蒼蠅中少于10種，這也說(shuō)明TRIM家族分布廣泛[16]。TRIM蛋白能抵抗病毒感染，參與炎癥反應(yīng)、自噬和腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等多種生物進(jìn)程[2]。TRIM蛋白主要通過(guò)3種途徑抵抗病毒感染：一是直接與病毒的核酸和衣殼蛋白相互作用；二是間接影響免疫相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而抑制病毒的感染和復(fù)制過(guò)程；三是與其它抗病毒因子共同抵御外來(lái)病毒的入侵[17]。TRIM21蛋白可抑制HIV和鼠腺病毒的復(fù)制，又可促進(jìn)HSV-1的感染，還可誘導(dǎo)IRF3/7和DNA感受器如DDX4的泛素化，提示TRIM21蛋白可激活I(lǐng)FN-I通路和抗病毒先天免疫[3]。此外，TRIM21蛋白還作為一種抗體受體，可通過(guò)HBx抗體依賴的胞內(nèi)中和機(jī)制抑制HBV的增殖[18]。本研究將對(duì)豬TRIM21基因進(jìn)行克隆和序列分析，為進(jìn)一步揭示其免疫學(xué)特點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)由本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol?Reagent試劑購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL10 000 DNA Marker、DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pCE2 TA/Blunt-Zero載體、DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI網(wǎng)站TRIM21序列設(shè)計(jì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 401 bp。上游引物：5′-ATGGCCTCAGCACTGCC-3′，下游引物：5′-CTACCAGCCCGTCCTCA-3′，引物由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取

將PAMs懸液置于無(wú)菌無(wú)酶的1.5 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，加入750 μL TRIzol?Reagent裂解細(xì)胞，參照TRIzol?Reagent試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，具體步驟如下：首先,在無(wú)菌無(wú)酶離心管中加入1 μL Oligo(dT)18，2 μL總RNA，5 μL RNase-free ddH2O，于65 ℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。然后配置cDNA合成反應(yīng)液：取上一步混合液8 μL，加入10 μL 2×RT Mix和2 μL HiScript Enzyme Mix，使用移液槍充分吹打混勻。最后在50 ℃條件下反應(yīng)45 min，隨后在85 ℃條件下反應(yīng)5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.4 PCR反應(yīng)

對(duì)反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃條件下預(yù)變性5 min，95 ℃條件下15 s，60 ℃條件下反應(yīng)15 s，72 ℃反應(yīng)產(chǎn)物2 min，共35個(gè)循環(huán)，然后72 ℃充分延伸5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠圖用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.5TRIM21基因的克隆與測(cè)序

回收目的片段，將純化PCR產(chǎn)物連接于pCE2 TA/Blunt-Zero載體上，使用DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性菌落并接種至含氨芐抗生素的培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)16 h，然后使用PCR對(duì)菌液進(jìn)行鑒定，最后將陽(yáng)性克隆送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.6TRIM21基因生物信息學(xué)分析

采用DNAStar軟件，將NCBI網(wǎng)站豬TRIM21基因序列與其它物種序列進(jìn)行比對(duì)，參考序列見表1。參照前人已經(jīng)報(bào)道的方法，采用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)豬TRIM21基因進(jìn)行生物學(xué)信息分析[19]。利用在線軟件ExPASy的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)程序預(yù)測(cè)TRIM21蛋白基本的理化性質(zhì)，利用ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/)程序預(yù)測(cè)TRIM21蛋白的親/疏水性。

表1 參考序列信息

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從PAMs提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得TRIM21基因的cDNA片段。以該cDNA片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 401 bp的片段。陽(yáng)性菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與TRIM21基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相似，符合預(yù)期結(jié)果，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功，結(jié)果見圖1。

M1，DL10 000 DNA Marker；1，豬TRIM21基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M2，DL2 000 DNA Marker；2，菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 豬TRIM21基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 核苷酸相似性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將豬TRIM21基因核苷酸序列與其它物種對(duì)比，結(jié)果顯示豬TRIM21基因與其它物種核苷酸的相似性為47.7%～86.0%，其中黃牛與豬的相似性最高(86.0%)，斑馬魚最低(47.7%)，結(jié)果見圖2。對(duì)比豬TRIM21基因序列與參考物種的TRIM21基因序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分析表明黃牛和山羊TRIM21位于同一分支，與豬TRIM21位于同一亞分支，三者親緣關(guān)系較近，斑馬魚與豬親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，結(jié)果見圖3。

圖2 TRIM21核苷酸相似性比對(duì)

圖3 TRIM21基因序列的進(jìn)化分析

2.3 TRIM21蛋白的生物信息學(xué)分析

對(duì)豬TRIM21蛋白分子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其分子式為C2372H3710N670O697S25，由469個(gè)氨基酸組成。分子質(zhì)量為53.57 ku，理論等電點(diǎn)為6.07，偏酸性。該蛋白含20種氨基酸，含量最多的是亮氨酸(占比10.7%)，其次為谷氨酸(占比9.8%)，結(jié)果見表2。該蛋白穩(wěn)定系數(shù)為60.66，屬于不穩(wěn)定蛋白。對(duì)豬TRIM21蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果顯示第274位氨基酸有最大疏水值1.711，第151位有最小親水值(-3.111)，親疏水性平均值為-1.4，說(shuō)明TRIM21為親水性蛋白，結(jié)果見圖4。

表2 豬TRIM21蛋白的氨基酸組成

圖4 豬TRIM21蛋白親/疏水性分析

3 討論

本研究克隆了豬TRIM21基因，通過(guò)在線軟件對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。將豬TRIM21基因與其它物種進(jìn)行核苷酸相似性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果一致，其中豬與黃牛、山羊位于同一亞分支，說(shuō)明豬與黃牛、山羊親緣關(guān)系較近，和其它生物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。TRIM21基因在不同物種間存在差異，表明其抗原性也會(huì)存在差異。軟件預(yù)測(cè)顯示豬TRIM21蛋白屬于親水性蛋白，且不穩(wěn)定系數(shù)較高，具有較強(qiáng)的抗原性和良好的柔韌性，表明該基因適合作為抗原制備抗體。有報(bào)道稱TRIM21蛋白可以活化NF-κB等信號(hào)通路[20]，進(jìn)而激活先天免疫反應(yīng)和抗病毒效應(yīng)，也可通過(guò)K48介導(dǎo)的泛素化作用，進(jìn)而通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)發(fā)揮先天免疫應(yīng)答的作用。從抗原性和親水性分析來(lái)看，TRIM21蛋白基因具有較強(qiáng)的親水性和抗原性，適合制備單抗。

TRIM21是由三種結(jié)構(gòu)域組成的蛋白，其中與抗病毒免疫密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域是PRYSPRY[21]。該結(jié)構(gòu)域可與具有抗病毒活性的蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮抗病毒功能[22]。TRIM21蛋白之所以能發(fā)揮抗病毒活性，不僅與PRYSPRY結(jié)構(gòu)域有關(guān)，還與其作為抗體的Fc受體參與先天免疫有關(guān)[20]。作為一種Fc受體，TRIM21蛋白目前僅在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IgG、IgM和IgA及同型抗體包裹的病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，TRIM21能迅速識(shí)別并中和病毒，從而抑制病毒復(fù)制[23]。此外，TRIM21作為一種E3泛素連接酶，可使機(jī)體細(xì)胞因子參與抗病毒先天免疫，并在機(jī)體內(nèi)保持穩(wěn)定。IRF1和IRF2在抗病毒防御反應(yīng)和自身免疫性疾病中能誘導(dǎo)TRIM21蛋白表達(dá)，發(fā)揮重要的免疫防御作用[24]。蛋白如何介導(dǎo)抗體與補(bǔ)體在宿主和病毒蛋白之間發(fā)揮作用，將成為下一步研究的內(nèi)容。

TRIM21蛋白廣泛參與機(jī)體的先天免疫和獲得性免疫，能對(duì)各種病原體的入侵發(fā)揮不同的免疫防御作用。本研究對(duì)豬TRIM21基因的相關(guān)功能初步探索，這不僅有利于更好地了解機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的特點(diǎn)，同時(shí)也為一些病原微生物如病毒感染相關(guān)疾病的預(yù)防與治療提供新思路，為該基因成為某些感染性疾病的生物標(biāo)志分子提供參考，在動(dòng)物疾病診斷中具有重要意義。

4 結(jié)論

豬TRIM21基因片段全長(zhǎng)1 401 bp，編碼469個(gè)氨基酸，pI為6.07，偏酸性，含20種氨基酸，屬于親水性蛋白。本研究成功克隆豬TRIM21基因，通過(guò)序列分析和在線生物信息學(xué)軟件等方法分析預(yù)測(cè)豬TRIM21基因的相關(guān)功能，為進(jìn)一步揭示豬TRIM21蛋白的免疫學(xué)特點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。