李苗 代菲 紀(jì)麗君 丁洪流

摘 要：目的：評(píng)估液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚(yú)肉中恩諾沙星殘留量的不確定度。方法：依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL06：2006）《測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南》（CNAS—GL05：2011），建立魚(yú)肉中恩諾沙星殘留量不確定度數(shù)學(xué)模型，分析其結(jié)果的不確定度來(lái)源。結(jié)果：當(dāng)魚(yú)肉中恩諾沙星含量為60.80 ?g/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為6.32 ?g/kg（k=2），不確定度主要來(lái)源于工作曲線擬合，標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制，儀器所產(chǎn)生的不確定度。結(jié)論：調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線的權(quán)重，提高檢驗(yàn)人員的操作水平，定期校準(zhǔn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，使其準(zhǔn)確，可提高樣品測(cè)定結(jié)果的可靠性。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;恩諾沙星;不確定度;魚(yú)肉

Uncertainty Evaluation for the Determination of Enrofloxacin in Fish by LC-MS/MS

LI Miao， DAI Fei， JI Lijun， DING Hongliu*

（Suzhou Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Suzhou 215104， China）

Abstract： Objective： The uncertainty of measurement in determination of enrofloxacin in fish by liquid chromatography-tandem mass spectrometry is evaluated. Method： According to“Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”（JJF 1059.1—2012）、 CNAS—GL06：2006 and CNAS—GL05：2011 ， the uncertainty for the determination of enrofloxacin in fish by LC-MS/MS was established， and the uncertainty sources of the results that may be introduced were analyzed. Result： When the content of enrofloxacin in fish was 60.80 ?g/kg， the expanded uncertainty was 6.32 ?g/kg（k=2）. The uncertainty mainly comes from the uncertainties that caused by the working curve fitting， the standard curve solution preparation and the uncertainty. Conclusion： Adjust the weight of the standard curve， improve the operation level of inspectors， and regularly calibrate liquid chromatography tandem mass spectrometry to make it accurate， so the reliability of the determination results?is improved.

Keywords： liquid chromatography tandem mass spectrometry; enrofloxacin; uncertainty; fish

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL06：2006）[2]和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[1]，參照農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告—1—2008 水產(chǎn)品中17種磺胺類(lèi)及15種喹諾酮類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]，對(duì)LC-MS/MS外標(biāo)法測(cè)定魚(yú)肉中恩諾沙星殘留量的不確定進(jìn)行分析，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持，保障實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、可靠性。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材

標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星（美國(guó)A Chemtek公司）;甲酸、甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）;無(wú)水硫酸鈉（650 ℃灼燒4 h，冷卻后貯存于密閉容器中備用，分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司）;實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水一級(jí)水。

1.2 儀器設(shè)備

ACQUITY UPLC/TQ-XS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，美國(guó)Waters公司;離心機(jī)，艾本德;Multi Reax渦旋儀，德國(guó)海道爾夫公司;超聲波清洗儀，德國(guó)Elma;多通道旋蒸儀，德國(guó)IKA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

稱(chēng)取5 g試樣于50 mL離心管內(nèi)，加入10 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋混勻，再加入于20 mL酸化乙腈，渦旋混合，超聲提取10 min。以4 000 r/min離心5 min，取上清液于梨形瓶中。殘?jiān)性偌尤?0 mL酸化乙腈溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，提取液于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)至干。加10.0 mL甲醇溶解殘留物，再加入2 mL正己烷渦旋混合30 s，轉(zhuǎn)入離心管中，以4 000 r/min離心5 min，棄上層液，取下清液，過(guò)0.22 ?m濾膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.2 不確定度來(lái)源分析

通過(guò)對(duì)測(cè)量過(guò)程的分析，并結(jié)合計(jì)算公式，可以歸納出以下幾個(gè)不確定度來(lái)源[5]。①測(cè)量重復(fù)性引起的不確定度（A類(lèi)）。②樣品前處理引起的不確定度（B類(lèi)）（天平引起的不確定度與1.0 mL移液管引起的不確定度）。③標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制帶入的不確定度（B類(lèi)）。④工作曲線擬合引起的不確定度（B類(lèi)）。⑤儀器引起的不確定度（B類(lèi)）。2D046ED9-E581-4F19-B6CA-233363C545A4

1.3.3 數(shù)學(xué)模型建立

數(shù)學(xué)模型建立如下：

（1）

式中：X樣為試樣中恩諾沙星的含量，?g/kg;

m樣為魚(yú)肉的質(zhì)量，g;C樣為樣液中恩諾沙星的濃度，ng/mL;CBlank為空白中恩諾沙星的濃度，ng/mL;

V為樣液最終的定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量重復(fù)性引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（d ）（A類(lèi)）

按農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告—1—2008方法對(duì)同一樣品平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表1。由重復(fù)性測(cè)定結(jié)果可得測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)偏差S，并計(jì)算重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（d）為：

式中：xi為第i次測(cè)量的測(cè)定值，?g/kg;n為測(cè)量次數(shù);x為n次測(cè)量所得的算術(shù)平均值，?g/kg。

2.2 樣品前處理引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（r）（B類(lèi)）

2.2.1 天平引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（r1）

稱(chēng)取5 g試樣，天平的準(zhǔn)確度a為0.01 g，采用矩形分布計(jì)算天平的不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 1.0 mL移液管引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（r2）

樣品前處理過(guò)程加入1.0 mL流動(dòng)相溶解殘留物，1.0 mL移液管準(zhǔn)確度a為±0.007 mL，見(jiàn)表2，采用矩形分布計(jì)算1.0 mL移液管的不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

將以上樣品前處理過(guò)程中各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，按照下列公式進(jìn)行合成，則樣品前處理引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（s）（B類(lèi)）

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確度引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（s1）

本實(shí)驗(yàn)采用的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液由BePure公司提供，濃度為100.2 ?g/mL，已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)給出的恩諾沙星的不確定度a為±3%（k=2），恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 稀釋體積帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（s2）

據(jù)《常用玻璃量器計(jì)量檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[4]A級(jí)玻璃量器的允差（表2），按均勻分布。各移液管和容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表2。

其中，1 mL移液管移取1.0 mL 100.2 ?g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容得到濃度為1 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將1 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛赛c(diǎn)為1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、40 ng/mL和50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，分別計(jì)算移液管和容量瓶的相對(duì)不確定值，見(jiàn)表3。

則稀釋體積帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

將以上標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制過(guò)程中各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，按照下列公式進(jìn)行合成，則標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制帶入的相對(duì)不確定度為：

2.4 工作曲線擬合引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（p）（B類(lèi)）

配制6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用LC-MS/MS重復(fù)測(cè)定3次，得到各濃度的色譜峰面積，用最小二乘法對(duì)恩諾沙星濃度-峰面積進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=ax+b（y為峰面積，x為濃度）和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

根據(jù)表4中標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y=91 996.2x+18 727.1，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各濃度點(diǎn)峰面積計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度的平均值x=21.83 ng/mL，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：s為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，;sxx為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和，;x為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值，x=21.83 ng/mL;x為對(duì)樣品進(jìn)行6次測(cè)定，由直線方程求得的樣品6次測(cè)定結(jié)果的平均濃度，ng/mL（6次測(cè)定濃度分別為30.31 ng/mL、30.41 ng/mL、29.55 ng/mL、30.32 ng/mL、30.66 ng/mL和31.19 ng/mL，則x=30.41 ng/mL）;b為工作曲線的斜率，為91 996.2;a為工作曲線截距，18 727.1;yj為第j個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，cps;xj為第j個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，ng/mL;n為測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的次數(shù)，n=6;p為測(cè)試樣品的次數(shù)，p=6。

2.5 LC-MS/MS儀器引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）（B類(lèi)）

經(jīng)檢定，LC-MS/MS儀器的不確定度為0.02，k=2，由LC-MS/MS儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表6。

由表6可知，魚(yú)肉中恩諾沙星檢測(cè)結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel為：

4 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定與結(jié)果

根據(jù)CNAS—GL06：2006[2]，取k=2，被測(cè)量值大約95%含于此區(qū)間，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為U=ucrel×k=0.051 90×2=0.104。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品中恩諾沙星的最佳估值為X=60.8 ?g/kg，則其擴(kuò)展不確定度為U=60.8 ?g/kg×0.104≈6.32 ?g/kg。

5 結(jié)論

在LC-MS/MS測(cè)定魚(yú)肉中恩諾沙星殘留量時(shí)，應(yīng)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線的權(quán)重，降低工作曲線擬合引起的不確定度，提高檢驗(yàn)人員的操作水平，定期對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，測(cè)試平行樣，嚴(yán)控前處理各環(huán)節(jié)，減少引入的不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目：表面增強(qiáng)拉曼光譜法同時(shí)檢測(cè)多種含氰基有害污染物的快速篩查技術(shù)應(yīng)用研究（SS019016）。

作者簡(jiǎn)介：李苗（1987—），女，江蘇徐州人，本科，工程師。研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

代菲（1979—），女，四川樂(lè)山人，本科，工程師。研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

紀(jì)麗君（1986—），女，山東德州人，碩士，高級(jí)工程師。研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

通信作者：丁洪流（1979—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，博士，正高級(jí)工程師。研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：416811320@qq.com。2D046ED9-E581-4F19-B6CA-233363C545A4