張曉梅 潘興富

(北京市化工職業(yè)病防治院，北京 100093)

硒是人體必需的微量元素，缺硒可引發(fā)大骨節(jié)病與克山病等[1-2]，硒過量又會引發(fā)毒害作用，所以準確測定人體內(nèi)硒含量意義重大。血是人體硒水平的生物標記物之一，可反應(yīng)人體幾天內(nèi)的硒水平，是國際上比較認可的硒監(jiān)測指標[3-4]。血液樣品中的硒檢測主要有原子吸收光譜法[5]、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法[6]、原子熒光光譜法[7]等，其中ICP-MS因靈敏度高、特異性強，但存在多原子干擾和質(zhì)譜干擾等問題[8]；原子吸收光譜法需根據(jù)樣品進行基體改進，操作繁瑣，周期長。目前，原子熒光光譜法因靈敏度高、檢測限低被廣泛應(yīng)用于土壤、食品、金屬材料等領(lǐng)域[9-11]，將原子熒光光譜應(yīng)用于血中硒的檢測研究主要集中在血清樣本，樣品前處理多用微波消解，而對于全血中硒的原子熒光光譜法檢測研究較少。樣品常用的消解法有干法、濕法和微波消解，其中干法消解溫度高，耗時長，微波消解耗時長，且消解后仍需趕酸，操作復(fù)雜，濕法消解操作簡單，耗時短，被廣泛應(yīng)用。由于生物樣本的珍貴性，檢測時降低樣本體積的必要性不言而喻，國外在十年前便提出了低體積概念，使小樣品分析成為許多環(huán)境和醫(yī)學(xué)相關(guān)研究目標的可能[12-13]，而我國在低體積樣品方面的研究未見報道。本文參考衛(wèi)生行業(yè)標準(WS/T 109—1999)《血清中硒的氫化物發(fā)生-原子吸收光譜法》[14]，低體積取樣后采用濕法消解，以消解效率為評價指標，優(yōu)化樣品的消解條件，調(diào)試儀器參數(shù)，建立全血中硒含量測定的原子熒光光譜分析方法，以期為監(jiān)測人群健康提供技術(shù)支持，同時為原子熒光光譜法檢測全血中硒的標準制定提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

AFS-9770原子熒光光度計(北京海光儀器有限公司)，配AS-50自動進樣器；智能型電熱板(林茂科技有限公司)；實驗中所用玻璃器具均以硝酸(50%)浸泡過夜，以去離子水清洗烘干后使用。

水中硒標準溶液(1 000 mg/L，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司)，全血質(zhì)控樣品(SeronormTMTrace Elements Whole Blood L-2 RUO)，硝酸(電子級70%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，高氯酸(AR 70.0%～72.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，鹽酸(GR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，硼氫化鈉(AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉(GR，北京化工廠有限責(zé)任公司)。

混酸(1+1)：濃硝酸與高氯酸按體積比1∶1混合。

氫氧化鈉(5 g/L)：稱取5.0 g氫氧化鈉溶于水中，冷卻后用水定容至1 000 mL。

硼氫化鈉堿溶液(10 g/L)：稱取10.0 g硼氫化鈉溶于氫氧化鈉中，用氫氧化鈉定容至1 000 mL。

鹽酸溶液(5+95)：吸取50 mL濃鹽酸緩慢加入900 mL水中，冷卻后用水定容至1 000 mL。

1.2 實驗方法

根據(jù)樣品中硒濃度與標準曲線線性范圍，調(diào)節(jié)儀器燈電流、負高壓等參數(shù)值，使其熒光強度響應(yīng)值在合適范圍。調(diào)節(jié)后的儀器參數(shù)為：載氣300 mL/min，屏蔽氣800 mL/min，負高壓280 V，原子化器高度8 mm，Se總燈電流60 mA，輔助燈電流30 mA。

1.2.1 標準系列配制與測定

用鹽酸溶液(5+95)將1 000 mg/L硒標準品逐級稀釋成100 μg/L標準使用溶液后配制成0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/L的標準系列。以鹽酸溶液(5+95)為載流，硼氫化鈉堿溶液(10 g/L)為還原劑，連續(xù)用標準系列的零管進樣，待讀數(shù)穩(wěn)定之后，將硒標準系列溶液按質(zhì)量濃度由低到高的順序分別導(dǎo)入儀器，測定其熒光強度，以質(zhì)量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標建立標準曲線。

1.2.2 樣品預(yù)處理與測定

取200 μL血樣，加入1.8 mL超純水后加1 mL混酸，于(150±10) ℃消解至淡黃色或無色透明并伴有白煙產(chǎn)生時，取下冷卻，加入0.5 mL濃鹽酸繼續(xù)加熱10 min，取下冷卻后定容至10 mL。

空白樣品：以200 μL超純水代替樣品，其他操作與樣品處理方法相同。

與測定標準系列溶液相同的條件下，分別測定空白、樣品溶液的熒光強度，與標準系列比較定量。計算方法如式(1)所示：

(1)

式中，ρ為樣品中硒的質(zhì)量濃度，μg/L；ρ1和ρ0分別為校準曲線計算出的試樣和空白試樣中硒的質(zhì)量濃度，μg/L；V0為樣品的定容體積，mL；V為樣品的取樣體積，mL。

1.2.3 消解效率評價方法

以市售質(zhì)控樣品為實驗材料，采用控制變量法優(yōu)化樣品前處理條件，以質(zhì)控樣品標準值為參考，分別計算各個不同條件下樣品的消解效率，具體計算方法如公式(2)所示，以消解效率評價優(yōu)化前處理條件。

(2)

式中，E為樣品的消解效率，%；ρ為測定樣品中硒的質(zhì)量濃度，μg/L；ρz為質(zhì)控樣品中硒的濃度值[本實驗所用質(zhì)控樣品的硒質(zhì)量濃度為(161±32) μg/L，消解效率計算中取161 μg/L作為ρz。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)以Excel統(tǒng)計，以O(shè)rigin 8.6作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線配制改進

比較標準曲線與工作曲線對樣品測定影響，分取不同體積的硒標準溶液，按照實驗方法進行消解，定容至10 mL后上機測定繪制工作曲線，標準曲線按照實驗方法進行配制，結(jié)果如表1所示。兩條曲線的相關(guān)系數(shù)均在0.995以上，對于同一質(zhì)控樣品的測定結(jié)果一致。以標準曲線測定濃度5 μg/L為工作曲線點，結(jié)果為(4.97±0.08) μg/L，進一步說明了標準曲線對于工作曲線的可取代性，建議直接以HCl(5%)將有證硒標準物質(zhì)稀釋后配制標準曲線，操作簡單且檢測效率高。

表1 不同曲線參數(shù)及樣品測定結(jié)果

2.2 樣品預(yù)處理方法的選擇

2.2.1 消解溫度的確定

取200 μL全血質(zhì)控樣品，加入1 mL混酸后，分別置于(120±10)、(150±10)和(180±10) ℃條件下進行消化。結(jié)果統(tǒng)計如表2所示。由表2可知，隨溫度上升，消解液顏色變淺，消解效率升高，但在(180±10) ℃消解30 min后，由于溫度較高，消解速率快，消解液揮發(fā)至近干，此過程中部分硒因溫度過高揮發(fā)損失，導(dǎo)致消解效率下降，這點與WS/T 109—1999中的說明相一致。所以實驗采用(150±10) ℃作為后續(xù)樣品消解溫度。在樣品前處理過程中需注意觀察消解狀態(tài)，防止消解溫度過高導(dǎo)致使消解效率下降。

表2 不同溫度下的消解情況

2.2.2 混酸添加量的確定

取5組血液樣品，分別加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL混酸，其余操作按照實驗方法進行，其消解效率變化如圖1所示?；焖崽砑恿?.5 mL時消解液最終呈黃色，消解不完全，消解效率僅為32.28%，混酸添加量1～2 mL時，均在80%以上，而混酸添加量為2.5 mL時，消解率有明顯下降?；焖崽砑恿看笥?.5 mL時，消解30 min后消解液面未出現(xiàn)白煙，故延長了消解時間?？赡苡捎谙鈺r間過長導(dǎo)致樣品中硒大部分轉(zhuǎn)變?yōu)榱鶅r硒，后續(xù)與鹽酸反應(yīng)不充分導(dǎo)致消解效率的下降。混酸添加量為1 mL時，平均消解率達到最大值89.61%。在確定樣品預(yù)處理方法時，盡量減少試劑用量以減少污染，所以本實驗采取混酸添加量為1 mL。

圖1 混合酸添加量對消解效率的影響Figure 1 The effect of the amount of mixed acid added on the digestion efficiency.

2.2.3 消解時間的確定

樣品在(150±10) ℃分別消解15、20、25、30、35 min后取下，其余操作按實驗方法進行。消解率變化如圖2所示。消解15 min時溶液呈黃色，基本澄清，但消解效率僅為67.32%，隨時間延長，消解效率先上升后趨于平緩，在30 min時達到最大值97.26%，繼續(xù)延長時間致使消解液近干，硒含量損失，消解效率下降，所以選取30 min作為消解時間。同時因電熱板控溫情況不同應(yīng)及時觀察消解液狀態(tài)，防止消解時間過長導(dǎo)致消解效率下降。

圖2 消解時間對消解效率的影響Figure 2 The effect of digestion time on digestion efficiency.

2.3 線性范圍與檢出限

配制0、1、2、4、6、8、10 μg/L共計7個濃度點，進行血中硒含量標準曲線的測定，其線性范圍為0～10 μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 2，根據(jù)GBZ/T 210.5—2008《職業(yè)衛(wèi)生標準制定指南第5部分生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法》中標準差法進行最低檢出濃度實驗。按上述優(yōu)化后的方法連續(xù)測定10次空白溶液，由測定值計算濃度平均值和標準差，以3倍標準差計算最低檢出濃度為0.143 μg/L。

2.4 方法準確度與精密度實驗

配制50、150、250 μg/L劑量水平的加標樣品，按照實驗方法進行處理，同批測定樣品濃度后計算精密度和加標回收率。結(jié)果顯示，樣品的平均加標回收率為90.9%～105%，精密度為1.5%～1.6%，方法的精密度和準確度均滿足生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法要求，見表3。

表3 準確度與精密度測試結(jié)果

2.5 質(zhì)控樣品測定

以Sero全血質(zhì)控為樣品，經(jīng)上述方法檢測，結(jié)果為(147.367±7.415) μg/L，符合質(zhì)控標準證書要求的(161±32) μg/L。根據(jù)質(zhì)控標準證書中其他金屬元素含量，推測樣品中較高含量金屬元素Pb (337±68) μg/L、Zn (7.1±1.4) mg/L、Cu (1.34±0.27) mg/L,對血中硒含量檢測基本無影響。

3 結(jié)論

建立了全血中硒含量測定的濕法消解-原子熒光光譜分析方法，測定全血中硒線性情況良好，相對標準偏差和平均加標回收率均符合職業(yè)衛(wèi)生標準生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法的相關(guān)要求，具有靈敏度高，精密度和穩(wěn)定性好等特點。方法前處理操作簡單，樣品用量和消解用酸量均較少，微波消解法取樣量一般為1 mL，而本實驗取樣量僅為200 μL，在很大程度上節(jié)省了實驗樣品和資源，也為環(huán)境和醫(yī)學(xué)相關(guān)研究中的小樣品分析提供了可能性。