梁春艷，張一凡，單秀峰，杜思琦， 朱旻鵬，肖志剛

（1.沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 沈陽 110034）

組織化植物蛋白具有良好的色澤，類似動物肉的纖維結(jié)構(gòu)和咀嚼感，可作為動物肉的部分替代品改善產(chǎn)品營養(yǎng)，降低生產(chǎn)成本[1-2]。高水分?jǐn)D壓技術(shù)在低水分技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展形成，是指在原料水分含量較高[3]（40%以上）的條件下，在溫度、剪切、壓力等物理場作用下，蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性、分子鏈取向、重新交聯(lián)后產(chǎn)生纖維狀結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)出組織化植物蛋白產(chǎn)品的技術(shù)[4]，其優(yōu)點(diǎn)為效率高、成本低、無化學(xué)污染，經(jīng)擠壓處理后的產(chǎn)品具有消化吸收率高、營養(yǎng)素?fù)p失少、貨架期長等特點(diǎn)[5]，產(chǎn)品無需復(fù)水，且在外觀、口感及組織形態(tài)上與動物肉更為接近。擠壓加工參數(shù)及物料水分等工藝條件對組織化蛋白的色澤、質(zhì)構(gòu)特性等有顯著影響。采用單因素試驗(yàn)，以高水分組織化大豆蛋白加工工藝參數(shù)（擠壓溫度、螺桿轉(zhuǎn)速、喂料速度、冷卻溫度、水分含量），對產(chǎn)品色澤、質(zhì)構(gòu)等的影響進(jìn)行了研究，為高水分組織化大豆蛋白的高效生產(chǎn)提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白含量87.94%），山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司提供；十二烷基硫酸鈉（SDS），大連美侖生物技術(shù)有限公司提供；尿素（Urea）、Folin酚甲試劑A、Folin 酚甲試劑B、Folin 酚乙試劑，北京索萊寶科技有限公司提供；2-巰基乙醇（2-ME），上海麥克林生化科技有限公司提供。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

雙螺桿擠壓機(jī)，濟(jì)南賽信機(jī)械有限公司產(chǎn)品；CT3 型質(zhì)構(gòu)儀，美國Brookfield 公司產(chǎn)品；CR-400型色差儀，柯尼卡美能達(dá)公司產(chǎn)品；Scientz-12N 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；SKD-200 型凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司產(chǎn)品；DR-3000 型系列酶標(biāo)分析儀，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司產(chǎn)品；Anti J-E 型高速離心機(jī)，貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司產(chǎn)品；S4800 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

擠壓溫度主要是指擠壓機(jī)蒸煮區(qū)的機(jī)筒溫度，5 段控溫前4 段雙螺桿擠壓機(jī)各段由進(jìn)料端至出料端的溫度設(shè)置分別為80，80，120，130 ℃。以大豆分離蛋白為原料，擠壓溫度、螺桿轉(zhuǎn)速、水分含量、冷卻溫度、喂料速度為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，控制其他因素不變，分別考查擠壓參數(shù)對組織化蛋白色澤、質(zhì)構(gòu)、組織化度的影響。擠壓工藝參數(shù)設(shè)置為出料端擠壓溫度150 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速280 r/min，喂料速度6 kg/h，冷卻溫度55 ℃，水分含量70%。

擠壓工藝單因素試驗(yàn)時(shí)，各因素水平設(shè)置如下：出料端擠壓溫度為130，140，150，160 ℃；螺桿轉(zhuǎn)速240，260，280，300 r/min；喂料速度5.5，6.0，6.5，7.0 kg/h；冷卻溫度45，50，55，60 ℃；物料水分含量64%，67%，70%，73%。

1.3.2 組織化大豆蛋白色澤測定

色澤采用色差儀測定，對采集完樣品的5 個(gè)不同部位測定色澤，取平均值，應(yīng)用L*，a*，b*表色系。L*為明度指數(shù)，值越大表明被測物越白亮。a*和b*值為彩度指數(shù)，a*值為正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠；b*值為正值表示偏黃，負(fù)值表示偏藍(lán)，絕對值越大表示偏向越嚴(yán)重。ΔE 表示產(chǎn)品與白色板的色差，值越大表示與白色板的差別越大[6]。

式中：L*s——標(biāo)準(zhǔn)白色板的測定值93.61；

a*s——標(biāo)準(zhǔn)白色板的測定值0.04；

b*s——標(biāo)準(zhǔn)白色板的測定值3.79。

1.3.3 組織化度測定剪切功和組織化度測定樣品形狀示意圖見圖1。

圖1 剪切功和組織化度測定樣品形狀示意圖

質(zhì)構(gòu)儀的操作參數(shù)為剪切模式，探頭NONE，夾具TA-SBA，測試前速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測試后速度1.0 mm/s，剪切程度75%。每個(gè)樣品重復(fù)測定5 次，去掉2 個(gè)最大值和最小值，取平均值。剪切功由質(zhì)量單位mJ 表示，采用垂直于擠出方向與平行于擠出方向的剪切力做功的比值定量表征產(chǎn)品纖維化程度的大小，即組織化度。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)測定

取硬度、彈性和咀嚼度等3 個(gè)指標(biāo)反映擠出物的質(zhì)構(gòu)特性。測定樣品裁剪為邊長25 mm 的正方形。質(zhì)構(gòu)儀的操作參數(shù)為TPA 模式，探頭TA7，測試前速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測試后速度1.0 mm/s，下壓程度10%。每個(gè)樣品測量5 次，取平均值。

1.3.5 蛋白質(zhì)溶解度

（1）浸提溶劑準(zhǔn)備。①0.01 mol/L pH 值7.6，磷酸鹽緩沖液（P）；②pH 值7.6，P+8 mol/L Urea 溶解液；③pH 值7.6，P+0.1 mol/L 2-ME 溶解液；④pH值7.6，P+1.5%（m/V）SDS 溶解液。

（2）樣品浸提與稀釋。不同工藝參數(shù)下的擠壓樣品，在冷凍干燥后粉碎，過80 目篩。取粉狀樣品0.25 g（精確至0.1 mg）于25 mL 燒杯中，分別加入10 mL 上述4 種溶劑，常溫下攪拌浸提2 h 后，重復(fù)浸提2 次，離心。取0.05 mL 上清液，加入去離子水0.95 mL 于離心管中，將其稀釋20 倍，混勻（搖床160 r/min，1 h）。加20 μL 到96 孔酶標(biāo)板的樣品孔中，采用Lowery 法測得（測定波長650 nm）上清液中可溶性蛋白含量，擠出樣品中總的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定。

根據(jù)張金闖和Liu Y 等人[4-5]的方法，由在不同溶液中的溶解度計(jì)算各種化學(xué)鍵交聯(lián)：（1）天然狀態(tài)蛋白，①；（2）氫鍵，②-①；（3）二硫鍵，③-①；（4）疏水相互作用，④-①。

1.3.6 掃描電鏡觀察

將冷凍干燥后的擠壓樣品，沿著擠出方向橫切和縱切，并將切片固定在樣品臺上，進(jìn)行噴金處理后，并使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡在2 kV 電子束操作下分析，放大30，300，500，1 500 倍觀察并拍照。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS（18.0）、Origin（2018）和Office Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝參數(shù)對組織化蛋白產(chǎn)品色澤的影響研究

工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白色澤的影響見表1。

表1 工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白色澤的影響

顏色在一定程度上反映了蛋白擠壓組織化過程中化學(xué)反應(yīng)的程度[7]。由表1 可知，隨擠壓溫度的升高，產(chǎn)品明度L*值在150℃時(shí)最好，溫度繼續(xù)升高，L*值降低，色澤加深，紅色度a*值先上升后下降，ΔE 值在150 ℃時(shí)最小，螺桿轉(zhuǎn)速、水分含量的增大，明度L*值先增大后減小，冷卻溫度升高，L*值減小，a*值先增大后減小，ΔE 值增大。溫度和水分是影響色澤的主要因素，較高的溫度使蛋白美拉德反應(yīng)加劇，產(chǎn)生類黑色素等物質(zhì)，色澤也隨之加深，從而使產(chǎn)品顏色加深，水分不僅起塑化劑的作用，還使產(chǎn)品黏度降低，形成適當(dāng)?shù)娜廴隗w，較高的含水量降低了美拉德反應(yīng)的速率，獲得人們可接受的色澤。

2.2 工藝參數(shù)對組織化蛋白產(chǎn)品組織化度的影響

工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白組織化度的影響見圖2。

圖2 工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白組織化度的影響

由圖2 可知，隨著擠壓溫度、螺桿轉(zhuǎn)速、喂料速度的增大，組織化度先升高后降低，物料水分的提高促進(jìn)組織化度提高，可能是因?yàn)樵谳^高水分環(huán)境中，天然狀態(tài)下呈球狀的大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)能夠更容易和更充分沿流動方向發(fā)生線性伸展[8]，從而使擠出物表現(xiàn)出更充分的組織化狀態(tài)，但水分含量在70%以上時(shí)，組織化度顯著下降，N Kitabatake 等人[9]發(fā)現(xiàn)，在70%濕度擠出物松散無定形，在80%的濕度下，蛋白質(zhì)變性似乎是不完整的[10]。冷卻溫度使充分冷卻，蛋白與蛋白相互作用增大，層流結(jié)構(gòu)相互交聯(lián)，促進(jìn)穩(wěn)定取向和交聯(lián)結(jié)構(gòu)，在55，60 ℃較好[11]，溫度過低不利于纖維結(jié)構(gòu)形成與定性。

2.3 工藝參數(shù)對組織化蛋白產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性的影響

工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白質(zhì)構(gòu)特性的影響見表2。

表2 工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表2 可知，隨著擠壓溫度的升高，產(chǎn)品的硬度和咀嚼性先增加后減小，隨螺桿轉(zhuǎn)速、喂料速度、冷卻溫度的升高，硬度和咀嚼性先降低后升高，隨著物料水分含量升高，硬度和咀嚼性降低，擠壓操作參數(shù)對彈性影響不大。隨著水分含量的增大，在物料和水的作用下，使產(chǎn)品硬度變軟，咀嚼性降低，可能導(dǎo)致不完整的組織化過程和較軟的組織[12]。Fujioy H N 等人[13]發(fā)現(xiàn)，自由水在展開的大豆蛋白分子之間起潤滑劑作用并填充到產(chǎn)品骨架中使擠壓產(chǎn)品更易取向物料濃度變稀，從而使擠出產(chǎn)品組織化度、硬度和咀嚼度變小。

2.4 工藝參數(shù)對組織化蛋白產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的影響

工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響見表3。

表3 工藝參數(shù)對組織化大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響

由表3 可知，隨著擠壓溫度和水含量的升高，蛋白的氫鍵作用力先升高后降低，喂料速度增大，氫鍵先降低后升高，冷卻溫度增大，氫鍵作用力下降。二硫鍵的作用力隨擠壓溫度和水分含量的升高，先升高后降低，喂料速度升高，二硫鍵先降低后升高，螺桿轉(zhuǎn)速和冷卻溫度升高，二硫鍵降低，在組織化過程中，蛋白質(zhì)分子內(nèi)原有的二硫鍵可能發(fā)生了少量的斷裂，并且高溫可能會加速該反應(yīng)的進(jìn)行[14]。擠壓溫度、螺桿轉(zhuǎn)速和水分含量升高，疏水作用先升高后降低，喂料速度增大，疏水作用先減小后增大，冷卻溫度增大，疏水作用升高。螺桿轉(zhuǎn)速提高，大豆蛋白熔融變性重組后疏水作用均增加，產(chǎn)品中以氫鍵和疏水作用的非共價(jià)鍵結(jié)合的大豆蛋白溶解度迅速增加[12]，但轉(zhuǎn)速過大時(shí)，物料之間摩擦變大，由于產(chǎn)品在機(jī)筒內(nèi)停留時(shí)間較短，氫鍵和疏水作用隨之減小，蛋白擠壓變形重組后的蛋白鏈在溫度冷卻段可能遭到破壞，冷卻溫度升高，組織化大豆蛋白中，由于蛋白混合充分，更多分子鏈的展開，更多的疏水基團(tuán)暴露[15]，疏水作用增大。在整個(gè)擠壓過程中，非共價(jià)鍵對維持蛋白構(gòu)象的貢獻(xiàn)最大，其次是共價(jià)鍵的影響，與之前[4，14]的報(bào)道一致。

2.5 掃描電鏡觀察

擠壓產(chǎn)品顯微結(jié)構(gòu)對比見圖3。

圖3 擠壓產(chǎn)品顯微結(jié)構(gòu)對比

選用2 種不同組織化度的組織化大豆蛋白樣品A（組織化度0.67），B（組織化度1.17），用掃描電鏡對樣品的橫、縱向切面進(jìn)行觀察。

由圖3 可知，顯微結(jié)構(gòu)下，（A1～A4，B1～B4，A5～A8，B5～B8 的放大倍數(shù)分別為30，300，500，1 500 倍），從橫切面來看，組織化度高的樣品B 比組織化低的樣品A 結(jié)構(gòu)更緊密，孔隙結(jié)構(gòu)的數(shù)量更多，但孔徑更小。由縱向切面可以看到，樣品B 有著更緊湊和更平滑的層狀結(jié)構(gòu)排列，層狀結(jié)構(gòu)明顯。充分混合和剪切力的作用下，大豆蛋白形成熔融態(tài)，表現(xiàn)出一定的膠凝性和成膜性，局部形成膜狀氣腔[16]，但其形成的纖維結(jié)構(gòu)比較粗，纖維結(jié)構(gòu)不明顯，孔隙比較多，結(jié)構(gòu)不緊密，從橫向和縱向可以看出在冷卻過程中組織化蛋白實(shí)現(xiàn)了水相和蛋白相之間的分離，形成纖維結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

隨著擠壓溫度的增大，產(chǎn)品硬度、咀嚼性先升高后降低，顏色加深，非共價(jià)鍵作用力增強(qiáng)后減弱，二硫鍵減弱；物料含水率增加，產(chǎn)品硬度、咀嚼性先升高后降低，色澤變淺，氫鍵、二硫鍵、疏水作用先增強(qiáng)后減弱；螺桿轉(zhuǎn)速增加，產(chǎn)品的明度先增加后減少，硬度、彈性、咀嚼性先減少后增加，蛋白質(zhì)主要以疏水作用力為主；固體喂料量增加，產(chǎn)品硬度、彈性、咀嚼性和相互作用力均先升后降；冷卻溫度升高，產(chǎn)品的硬度、彈性、咀嚼性先減少后增加。為優(yōu)化高水分大豆蛋白參數(shù)，提供了有效的工藝參數(shù)理論依據(jù)，也為在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可靠的技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)。