鄭小敏 尤曉惠 王瑋 王美鋒 向鵬宇

摘 要：為了解我國56種香辛料中去甲烏藥堿的含量范圍，通過對不同地區(qū)、不同產(chǎn)地、不同品種的香辛料的含量測定，掌握香辛料中去甲烏藥堿含量現(xiàn)狀。本文對重慶市各大香辛料批發(fā)市場及網(wǎng)絡(luò)平臺進行隨機采樣，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法經(jīng)Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分離，電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，同位素內(nèi)標法對去甲烏藥堿進行定性定量分析。結(jié)果表明，56個品種中有6種香辛料含有去甲烏藥堿，其中，木姜子、月桂葉中去甲烏藥堿含量較高;同一品種不同產(chǎn)地的花椒含量存在顯著差異;紅花椒中去甲烏藥堿含量普遍高于青花椒。

關(guān)鍵詞：去甲烏藥堿;香辛料;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Analysis of the Content of Higenamine in Spice

ZHENG Xiaomin， YOU Xiaohui， WANG Wei， WANG Meifeng， XIANG Pengyu

（Chongqing Fuling Institute for Food and Drug Control， Chongqing 408000， China）

Abstract： To understand the content range of higenamine in 56 kinds of spices in China， and to master the content status of higenamine in ?different spices from different regions and different producing areas. Random samples were collected from major spices wholesale markets and online platforms in Chongqing. The samples were separated by Waters CSH C18 column （100 mm×2.0 mm， 1.7 μm） by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， electrospray ionization positive ion scanning， and multi-reaction monitoring mode detection. The qualitative and quantitative analysis of higenamine was carried out by isotope internal standard method. The results show that， 6 spices of 56 cultivars contained higenamine， among which， the content of higenamine was higher in the seeds of Zingiberaceae and the leaves of laurel; The content of zanthoxylum from the same variety and different producing areas was significantly different. The content of noraconite in red prickly ash is generally higher than that in green prickly ash.

Keywords： higenamine; spices; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

去甲烏藥堿（Higenamine，HG）屬于芐基異喹啉類生物堿，是一種β受體激動劑類藥物，它能夠增加動物心肌收縮力，改善收縮和舒張功能，并具有興奮心肌細胞、刺激β-腎上腺素受體、舒張血管的作用，因此在臨床上可被用作強心劑[1-4]。自2017年起，去甲烏藥堿就被國際反興奮劑組織（World Anti-Doping Agency，WADA）列為S3類（β-2激動劑類）違禁物質(zhì)[5]。去甲烏藥堿主要存在于細辛、黃柏、地膚子[6]、花椒、胡椒、桂皮[7-8]等天然植物中，這些植物正是中藥材或日常食用香辛料中的組成部分。因此，運動員極有可能在日常飲食中攝入去甲烏藥堿而造成興奮劑檢測陽性檢出。本文通過各大香辛料批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、中藥材市場、商超及網(wǎng)絡(luò)平臺進行采樣，采用液色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行不同品種的香辛料中去甲烏藥堿的含量分析[8]。

1 材料與方法

1.1 采樣

以《天然香辛料 分類》（GB/T 21725—2017）為依據(jù)制定采樣方案，對重慶市各大香辛料批發(fā)市場、中藥材批發(fā)市場及網(wǎng)絡(luò)平臺進行采樣，共采集花椒、辣椒、白胡椒、桂皮、八角、孜然、多香果、草果、高良姜、月桂葉、丁香、蓽撥、三奈、香茅草、茴香、芫荽、甘草、砂仁、姜黃、白豆蔻、肉豆蔻、香豆蔻、百里香、芝麻、大蒜、白歐芥、調(diào)料九里香、香椿、芒果、楊桃、細葉芹、葫蘆巴、留蘭香、迷迭香、香莢蘭、羅晃子、歐芹、菖蒲、甘牛至、石榴、薄荷、辣根、洋蔥、姜、木姜子、小蔥、大蔥、甜羅勒、蒔蘿籽、葛縷子、小豆蔻、芹菜籽、龍蒿、牛至、藏紅花及大清桂56種香辛料。進行樣本分類，每個品種采樣量不少于200 g，每種樣品不少于3批次;并對含有去甲烏藥堿香辛料進行大量采集，覆蓋主要產(chǎn)地。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1290-AB 4500 高效液相色譜聯(lián)用儀（美國AB 公司）;XPE204電子分析天平（梅特勒-托利多），VORTEX3渦旋儀（德國IKA公司），SR-2DS強力振蕩器（日本TAITEC公司），Multifuge XIR冷凍離心機（德國ThermoFisher公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標液配制

準確稱取去甲烏藥堿對照品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液;用甲醇逐步稀釋成濃度為

1 μg/mL的標準使用液;于-18 ℃冷凍保存。

稱取去甲烏藥堿-D4對照品1 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為

100 μg/mL的內(nèi)標標準儲備液;精密吸取甲烏藥堿-D4內(nèi)標標準儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成1 μg/mL去甲烏藥堿-D4內(nèi)標標準使用液;于-18 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品前處理

本實驗采用內(nèi)標法進行定量分析。樣品粉碎均勻，過60目篩，稱取試樣1.0 g（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入去甲烏藥堿-D4標準使用液100 μL（1 μg/mL），加入19 mL 0.5%甲酸乙醇/水（80+20）溶液，振蕩30 min，8 000 r/min離心5 min;提取液轉(zhuǎn)移至20 mL比色管中，用5%氨水調(diào)節(jié)pH值至8.5±0.5，加水定容至20 mL，混勻。

PBA固相萃取小柱依次用3 mL乙腈、3 mL0.5%甲酸水、3 mL 0.2 mol/L乙酸銨（pH為8.5）活化。取5 mL上述提取溶液，上柱，依次用3 mL 0.2mol/L乙酸銨（pH為8.5）淋洗、3 mL水淋洗;2 mL 0.5%甲酸甲醇洗脫，抽干小柱，收集洗脫液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 0.5%甲酸水復溶，0.22 μm濾膜過濾，上機分析。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法經(jīng)Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分離，電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，同位素內(nèi)標法定量測定。

1.3.3 儀器條件

（1）液相條件。柱溫：40 ℃;進樣量：2 μL;流動相A：0.1%甲酸乙腈，流動相B：0.1%甲酸水;

流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式;電噴霧電壓（IS）：5 500 V;霧化氣壓力（GS1）：

55 psi;輔助氣壓力（GS2）：55 psi;氣簾氣壓力（CUR）：35 psi;碰撞氣體（CAD）：Medium;離子源溫度（TEM）：550 ℃。

去甲烏藥堿定量離子對：272.0/107.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：26 V;去甲烏藥堿定性離子對：272.0/255.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：20 V;去甲烏藥堿-D4離子對：276.0/259.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：21 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限和定量限的測定

將去甲烏藥堿標準儲備液用甲醇稀釋至一定濃度，再分別取適量于10 mL容量瓶中，分別加入適量去甲烏藥堿-D4內(nèi)標標準使用液，甲醇稀釋成一定梯度的系列標準溶液按照1.3.3儀器條件進行測定，以去甲烏藥堿的濃度與去甲烏藥堿-D4濃度比值作為橫坐標，以去甲烏藥堿定量離子峰面積與去甲烏藥堿-D4峰面積比值為縱坐標進行回歸分析，去甲烏藥堿濃度在0.25～100.00 ng/mL關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.999。當S/N≥3作為方法的檢出限;S/N≥10作為方法的定量限。各品種方法檢出限為

1 μg/kg，定量限為3 μg/kg。

2.2 精密度實驗

根據(jù)香辛料的使用部位不同，將香辛料分為葉類、果實類、根莖類及花類等，選取甘草、甘牛至、茴香、桂皮、芝麻、丁香及芹菜籽等7種有代表性的不同類型樣品進行精密度實驗，并分別添加3個不同濃度的標準溶液，每個加標水平設(shè)置6個平行樣，以考察方法的精密度和回收率，以試劑溶液配制標準曲線，內(nèi)標法定量。如表2所示，平均回收率范圍為92.8%～108.2%，相對標準偏差范圍為1.9%～5.6%。

2.3 檢測結(jié)果

由檢測結(jié)果可知，花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子等6種香辛料中檢出了去甲烏藥堿，其中，木姜子和月桂葉中去甲烏藥堿含量偏高，見表3。

2.4 花椒中去甲烏藥堿的含量分析

本研究中檢出去甲烏藥堿的其他5個品種產(chǎn)地比較集中，且產(chǎn)量少;而花椒是生活中最常見的食物，是我國主要香辛料之一，也是我國優(yōu)勢特色農(nóng)產(chǎn)品，產(chǎn)量大，使用范圍廣，在我國大部分地區(qū)都有種植，因此本研究對陜西、四川、重慶、云南和甘肅產(chǎn)地花椒進行采樣，共采集樣品52批次，分析結(jié)果見表4。

各產(chǎn)區(qū)主產(chǎn)品種分別是四川（紅花椒）、陜西（紅花椒）、重慶（青花椒）、云南（青花椒）。通過Excel分別對去甲烏藥堿含量進行t檢驗分析，結(jié)果表明，青花椒和紅花椒中去甲烏藥堿的含量具有顯著性差異，紅花椒中去甲烏藥堿的含量明顯高于青花椒。

3 討論

對56種香辛料中去甲烏藥堿進行篩查，其花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子6種香辛料中檢出去甲烏藥堿，月桂葉和木姜子中含量較高。其中桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子在我國的產(chǎn)地相對比較集中。而花椒作為主要的香辛料之一，在我國被廣泛種植，各產(chǎn)區(qū)主產(chǎn)品種又各不相同，通過采樣分析，紅花椒的含量明顯高于青花椒。

香辛料中去甲烏藥堿的篩查和含量測定，對56種香辛料中去甲烏藥堿含量有了一個初步了解，本次分析主要針對重慶市各大香辛料批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、中藥材市場、商超及網(wǎng)絡(luò)平臺進行采樣，對香辛料進行摸底，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，內(nèi)標法定量分析測定。其中，6種常用香辛料中檢出去甲烏藥堿，其余均未檢出，提示運動員和心血管患者需特別慎用。

參考文獻

[1]石曉路，武乾，崔海峰，等.去甲烏藥堿與6-姜酚配伍對心衰大鼠強心機制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（2）：420-423.

[2]侯平，楊麗，劉寧，等.麻黃堿、β-細辛醚和去甲烏藥堿對大鼠心肌細胞鈣離子濃度和細胞膜鈣通道的影響[J].中國醫(yī)科大學報，2013，42（3）：201-203.

[3]王曉霞，韓源.鹽酸去甲烏藥堿負荷試驗在99Tcm-MIBI心肌灌注顯像中不良反應(yīng)的觀察[C]//中華醫(yī)學會第九次全國核醫(yī)學學術(shù)會議論文集.西安：陜西省醫(yī)學會，2011：124.

[4]陳寶玲，鄭英麗，陸直，等.HPLC法測定去甲烏藥堿的含量[J].中國新藥雜質(zhì)，2014，13（7）：628-630.

[5]中國反興奮劑中心.關(guān)于加強去甲烏藥堿陽性風險防控有關(guān)事宜的通知[EB/OL].（2016-11-04）[2022-02-05].https：//www.chinada.cn/contents/6/613.html.

[6]田海峰，衣濤，金東日，等.柱前衍生化高效液相色譜法測定蓮子心中去甲烏藥堿的含量[J].延邊大學學報（自然科學版），2012，38（2）：150-153.

[7]楊明，何思睿，張丹，等.常用藥材中去甲烏藥堿的LC-MS/MS測定方法研究[J].中國測試，2018，44（3）：61-65.

[8]楊明，陳丹，涂鳳琴，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定香辛料中的去甲烏藥堿[J].現(xiàn)代食品科技，2020，36（3）：275-280.